1 理論
オリゴヌクレオチドは、固相担体に取り付けられた3´から5´端まで伸びる1塩基ずつの付加によって合成される。 オリゴヌクレオチドの化学合成が完了すると、DNA鎖は水酸化アンモニウムとのインキュベーションによって固体支持体から解放される。 アンモニウムは脱保護剤としても作用し、ホスホジエステル結合のリン酸塩を保護している基を切断する。 この後、高温のアンモニアを加えて、デオキシアデノシン、デオキシシトシン、デオキシグアノシンの外環式アミノ基から保護基を加水分解させる。 オリゴヌクレオチドは、アンモニア溶液のまま粗製品としてユーザーに供給される可能性がある。 この場合、使用前に、脱保護中に生じた塩および副産物をオリゴヌクレオチド調製物から除去する追加の工程を実施する必要がある場合がある。
脱保護後、オリゴヌクレオチド調製物は通常脱塩、定量、凍結乾燥器で乾燥まで蒸発し、粉末状で使用者に供給される。 脱塩されたオリゴヌクレオチド溶液は、全長のオリゴヌクレオチドを含むが、化学合成中に蓄積された切断された生成物の混合物も含む。 切断は、指定された塩基が対応するサイクルで鎖に付加されない場合に起こる（Hecker & Rill, 1998）。 したがって、調製品に蓄積される切断された生成物の割合は、合成効率（合成後の完全長生成物の割合）と分子の長さによって決定される。 合成に多くのサイクルを必要とする長いオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドに比べ純度が低くなる。 これらの失敗は、いくつかのアプリケーションにおいて全長製品と競合し、オリゴヌクレオチドを使用する前に除去する必要があるかもしれない。
50塩基より長いオリゴヌクレオチドをさらに精製することは、調製物中の全長製品の割合が通常80%以下であるため推奨されます。 ゲルシフトアッセイ、部位特異的変異導入、配列決定、クローニングアダプターの作製、ライブラリ作成のための第一鎖cDNA合成など、オリゴヌクレオチドの正確な長さが重要な用途では、短いオリゴヌクレオチドでも追加の精製を推奨します（上記の「タンパク質と核酸の相互作用に関するスタンダードin vitroアッセイ-RNAおよびDNA結合と部位特異的変異導入に関するゲルシフト法」の技術の詳細についてを参照ください）。
精製は、オリゴヌクレオチドの合成後、または酵素による修飾後に必要となる場合があります。
逆相HPLCによる精製は、疎水性に基づいて行われ、精製方法はオリゴヌクレオチドの性質と、それが目的とする用途に依存します。 非極性固定相を用い、水性緩衝液と有機溶媒を移動相として分析物を溶出する。極性化合物が最初に溶出され、非極性化合物は保持される。 ビオチン、蛍光色素標識、NHS-エステル結合などの疎水基で修飾されたオリゴヌクレオチドの精製に最適な方法である。 PAGE精製に比べて質量回収率が高く、不完全な生成物はあまり除去できないが、より多くのオリゴヌクレオチド（mmoleスケール）を精製することが可能である。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）は、オリゴヌクレオチドをその長さに応じて分解し、それによって完全長生成物と失敗した分子とを区別するのに十分な分解能を提供します（アトキンソンとスミス、1984）。 ポリアクリルアミドゲルは、アガロースゲルよりもDNAの小さな断片を分離するのに有効である（分析的ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるRNAの分析およびアガロースゲル電気泳動を参照）。 ポリアクリルアミドゲルの唯一の欠点は、アガロースゲルに比べて調製と取り扱いが難しいことである。 ポリアクリルアミドゲルは、一定の電場中で垂直方向に走らせる。 電気泳動後、オリゴヌクレオチドはゲルから溶出され、エタノール沈殿（核酸の沈殿については、RNA精製 – 沈殿法 を参照）または逆相クロマトグラフィーにより濃縮される。 この方法は、要求の厳しいアプリケーションで、完全長のオリゴヌクレオチドを高い割合で得たい場合に選択される方法である。 また、30塩基以上のオリゴヌクレオチドに強く推奨されます。 また、複数のサンプルを同時に実行することができ、高価な装置は必要ありません。 この手法の唯一の欠点は、1回の精製で得られるオリゴヌクレオチドの量が少ないことである。 通常、オリゴヌクレオチドは1μmol以下のスケールで使用され、PAGE精製後の質量回収率は< 50%、変性オリゴヌクレオチドの場合はさらに低くなる。
オリゴヌクレオチド調製物は、変性ポリアクリルアミドゲルに、レーンあたり少なくとも1mgの量でロードされる。 ゲルの分解能の範囲は、ポリアクリルアミドの濃度に依存する。 短いオリゴヌクレオチド（15～35塩基）では、13～15％のポリアクリルアミドゲルを推奨する。長いオリゴヌクレオチド（35～70塩基）では、8～13％のポリアクリルアミドゲルを推奨する。 ゲルの割合は、ランニングシステムに合わせる必要があります。 我々は通常、Bio-Rad Mini Protean II システムを使用し、25塩基長のオリゴヌクレオチドを精製するために15%ゲルを実行する。
本章では、ポリアクリルアミドゲルからオリゴヌクレオチドを精製する2つの異なる方法について説明します。 最も単純な方法は、拡散による溶出である。 これは、高濃度の領域から低濃度の領域への分子の動きに基づいている。 拡散の結果、物質が徐々に混ざり合っていく。 この方法は時間がかかるが、あまり多くの労力と設備を必要としない。 基本的には、目的のオリゴヌクレオチドを含むポリアクリルアミドバンドを小さく切り刻み、溶出バッファーで覆います。 インキュベーション後、上澄み液からエタノール沈殿によりDNAを精製する。 収量はオリゴヌクレオチドの長さにより20％～70％と制限される。
2つ目の方法は、透析バッグへの電気溶出です（McDonellら、1977）。 オリゴヌクレオチドを含むゲル片を切り出し、緩衝液の入った透析バッグに入れる。 電流を流すと、DNAはゲルから透析バッグのバッファーに移動する。 このバッファーからオリゴヌクレオチドを回収し、精製する。 この方法では、オリゴヌクレオチドを収量よく単離することができるが、ゲルのバンドを一つ一つ透析バッグに入れる必要があるため、多数のサンプルを同時に精製する場合は時間がかかる。 この方法は、より大きなDNA断片にも有効で、アガロースゲルからDNAを抽出することもできる。