Burden of Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii Infection in Hospitalized Patients in a Tertiary Care Hospital of Nepal

Introduction

アシネトバクター・バウマニとは好気性細菌です． 非発酵性、グラム陰性、非運動性で、多くの有効な病原因子を保有するコッコバシル菌である。1 この菌は、幅広い環境条件下で生存することができ、表面上に長時間留まるため、感染症の発生や医療関連感染の原因となることが多いのです2。病院環境におけるA. baumanniiによる主な問題は、集中治療室（ICU）の重症患者、特に機械換気を要する患者や、傷や熱傷を持つ患者に関するものが大半を占めています。 A. baumannii に関連する感染症には、人工呼吸器関連肺炎、皮膚・軟部組織感染症、創傷感染症、尿路感染症、二次性髄膜炎、血流感染症などがあります3

アシネトバクター・バウマニは、世界中で重要なMDR院内病原体となり、過去10年間にますます報告されていますが、おそらく入院患者に広域スペクトル抗生物質を使うようになってきたことが原因となっています4。 米国感染症学会（ISDA）は、A. baumannii を、現在の抗菌薬の有用性を大きく脅かす「赤色警報」病原体の1つとして挙げています5。多くの研究により、MDR A. baumannii の陽性率は上昇傾向にありますが、耐性率は病院、都市、国によって大きく異なる可能性があることが示されています。 6

多剤耐性 A. baumannii は、重症感染症の治療薬として選択されるカルバペネム系抗生物質をはじめ、使用可能なほとんどの抗生物質に対して耐性を獲得しています7。 A. baumanniiのβ-ラクタム耐性の主なメカニズムは、エフラックスポンプ、ポリン変異、後天性β-ラクタム加水分解酵素、すなわちクラスA（拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ、ESBL）、クラスB（メタロβ-ラクタマーゼ、MBL）、クラスCアンピシリナーゼ（AmpC）やクラスDβ-ラクタマーゼの生産に対応するものである。 MBLやその他のカルバペネマーゼ産生によるカルバペネム耐性は、プラスミドを介することが多いため、病院環境で急速に広がる可能性があり、入院患者のA. baumannii感染症治療に用いる抗生物質を適切に選択し、病院環境での伝播を防ぐために有効な感染制御対策を開始するには、薬剤耐性を早期に検出する必要がある8,9。

以上の見解を踏まえ、入院患者から分離されたA. baumanniiの抗生物質感受性パターンの決定、MDR株の同定、MDR株中の各種β-ラクタマーゼの検出を目的とした研究を行った。

材料と方法

実験室ベースの研究は、2017年1月から2017年12月まで（12か月間）ネパールの三次医療センターであるTribhuvan University Teaching Hospital（TUTH）の臨床微生物学教室で実施されました。 さまざまな身体部位を代表する感染症が疑われる入院患者から採取したすべての臨床検体（喀痰、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引液、膿およびスワブ検体、異なる体液、尿、血液、カテーテル先端など）を、A. baumanniiの分離および同定のために米国微生物学会（ASM）が推奨する標準微生物法に従って処理しました10。

抗生物質感受性試験 (AST)

分離した A. baumannii のさまざまな抗生物質に対する感受性は、Mueller-Hinton 寒天を用いた修正 Kirby-Bauer ディスク拡散法によって測定し、米国臨床検査標準協会 (CLSI) のウェインが推奨する標準手順に従って解釈しました11。 A. baumanniiのすべての分離株の抗生物質感受性プロファイルは，アンピシリン・スルバクタム（10/10 μg），セフタジジム（30 μg），ゲンタマイシン（10 μg），シプロフロキサシン（5 μg），レボフロキサシン（5 μg），メロペネム（10 μg）およびイミペネム（10 μg）を用いて試験することにより測定された。 また，上記3種類の抗菌薬群のうち少なくとも1種類に耐性を示した分離株（MDR株）については，piperacillin（100 μg），piperacillin-tazobactam（100/10 μg）についても試験を行った。 セフォタキシム（30μg）、セフェピム（30μg）、コトリモキサゾール（25μg）、アミカシン（30μg）、ドキシサイクリン（30μg）、ポリミキシンB（300単位）、コリスチン硫酸（10μg）はHiMedia Laboratories, Indiaから。

Identification of MDR Isolates

多剤耐性A. baumannii分離株は、欧州疾病予防管理センター（ECDC）が推奨するガイドラインに従って同定された。 3つ以上の抗菌薬クラスの少なくとも1つの抗菌薬に非感受性の分離株は、MDRとして識別された12

拡張スペクトラムβラクタマーゼ（ESBL）産生の検出

ESBL産生の初期スクリーニング試験は、セフタジジム（CAZ、30μg）およびセフォタキシム（CTX、30μg）のディスクによる試験で行われました。 ZOI（Zone of Inhibition）が<18 mm（CAZ）または<23 mm（CTX）の場合にESBL産生菌と判定された。 スクリーニングテストでESBL産生が疑われた分離株は，ESBL産生の確認のため，CAZとCTXの単独およびclavulanic acidとの併用ディスク（CD）法でさらに試験を行った。 35±2℃で16～18時間培養後，いずれかの抗菌剤とclavulanic acidを併用した場合の阻止域が単独で培養した場合より5 mm以上増加した場合，ESBL産生菌と判定した11．

AmpC β-ラクタマーゼ産生菌の検出

セフォキシチン（CX、30μg）ディスクで<18 mmの阻止域を生じたアシネトバクター・バウマニーについてAmpCβ-lactamase産生の検査を実施した。 AmpCディスクテストによりAmpC β-lactamaseの検出を行った。 本法は，標準MHAプレートにcefoxitin感受性Escherichia coli指標株（ATCC 25922）を接種して芝生培養を行い，cefoxitinディスクを設置した。 ブランクディスク（直径6 mm，Tris-EDTA緩衝液で湿潤）は試験菌株を数コロニー接種し，セフォキシチン・ディスクの横に置いた。 このプレートを37℃で一晩培養した。 13

メタロ-β-ラクタマーゼ（MBL）およびKlebsiella pneumoniae カルバペネマーゼ（KPC）産生の検出

メロペネム（MEM、10μg）耐性の分離株を対象にMBLとKPC産生の検出を実施した。 MBL，KPC，KPC/MBL co-producerの検出と鑑別にはTsakrisら14の記載したcombination meropenem disk methodを適用し，この試験には4枚のディスクを使用した。 (a) MEM = プレーンMEMディスク（10μg），(b) MEM+EDTA = MEMディスク（10μg）に292μgのEDTA，(c) MEM+phenylboronic acid (PBA) = MEMディスク（10μg）に400μgのPBA，および (d) MEM+EDTA+PBA = MEMディスク（10μg）に292 μg of EDTA と400 μg of PBAを加えたものであった。 EDTAはMBLの阻害剤として、PBAはKPCの阻害剤として作用する。 試験は、標準拡散法に準じてMueller-Hinton寒天培地に試験菌を接種し、ディスクを4枚貼付して行った。 37℃で一晩培養後，MEM+EDTA，MEM+PBA，MEM+EDTA+PBAディスク周辺のZOI径をプレーンMEMディスク周辺と比較した． MEM+EDTAおよびMEM+EDTA+PBAディスク周囲のZOI径が，MEMディスク単独周囲のZOI径より5mm以上大きくなった場合をMBL産生とした． MEM+PBAおよびMEM+EDTA+PBAディスク周囲のZOI径が、MEMディスク単独周囲のZOI径よりも≧5mm増加した場合に、KPCの生成とみなした。 MEM＋EDTA＋PBAディスク周囲のZOI径が、MEMディスク単独周囲のZOI径よりも≧5mm増加した場合に、KPC酵素とMBL酵素の両方が共産化されたと考えられる。

データ処理と分析

患者の人口統計、検体、病室、抗菌プロファイル、耐性決定因子に関するデータは、SPSS 16.0 版を用いて分析し、頻度分布とパーセントに従って解釈しました。

MDR Acinetobacter baumanniiの分布

161株のMDRのうち、大部分（47.2％）が呼吸器検体（喀痰，気管支肺胞洗浄液，気管吸引液）から分離され，次いで膿や綿棒，体液，尿，血液，最小はカテーテル先端からの分離（1.2％）であった（Table 1）。 MDR菌は，男性58.3％，女性41.7％から分離され，男女比は1.4であった。 The highest number of isolates were from male patients with age group ≥65 years (14.9%) and the least number was isolated from a female patient with age group 49–64 years (5.0%) (Table 2). Similarly, the higher number of MDR isolates were isolated from ICU patients (49.6%) followed by surgical wards (19.9%) and medical wards (14.3%), while the lowest number from burn wards (1.9%) (Table 3).

Table 1 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii in Various Clinical Specimens

Table 2 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii by Gender and Age Group of Patients

Table 3 Ward Wise Distribution of MDR Acinetobacter baumannii

Antibiogram of MDR Acinetobacter baumannii

抗生物質感受性プロファイルは、ほとんどのMDR分離菌が第一世代の耐性であることを示しています。ライン抗生物質 その中で，piperacillinとcefotaximeには全例が完全耐性であった。 同様に，ceftazidimeとcefepimeに99.4％，cotrimoxazoleに98.7％，piperacillin-tazobactamとciprofloxacinに95％，gentamicinに93.8％，ampicillin-sulbactamとmeropenemに89.4％の耐性がみられた． また，levofloxacin，imipenem，amikacin，doxycyclineに対する感受性はそれぞれ11.8％，12.4％，13.6％，37.9％にとどまり，amikacin，doxycyclineに対する感受性の低下は認められなかった。 MDR菌はすべて最終手段であるポリミキシンBとコリスチン硫酸塩にのみ完全感受性であった（図1）。

Figure 1 Percentage of antimicrobial resistance and sensitivity of MDR A. baumannii (N = 161).

ESBL, AmpC, MBL, and KPC Production in MDR Acinetobacter baumannii

In this study, the rate of β-lactamases production among MDR isolates was significantly high. MBL was the common β-lactamase detected among MDR A. baumannii (67.7%). ESBL was detected in 19.9%, AmpC in 38.5%, and KPC in 9.3% of MDR isolates. The co-production of different types of β-lactamases was also seen among some isolates. ESBL+AmpC co-producers were seen in 6.8%, ESBL+MBL co-producers in 5.0%, AmpC+MBL co-producers in 23.0% and MBL+KPC in 5.6% of MDR isolates (Table 4).

Table 4 β-MDRアシネトバクター・バウマンニにおけるラクタマーゼ産生

議論

アシネトバクター・バウマンニは入院患者、特に集中治療室での様々な疾病と関連し、患者の管理および感染制御により大きな挑戦を課す重要な院内病原菌である。

本研究では、MDR A. baumanniiは呼吸器系の検体から多く分離され（47.2%）、次いで膿やスワブ（27.3%）、体液（11.1%）などであった。 2015年にShresthaらが同じ病院で行った研究15でも呼吸器検体からMDR A. baumanniiが49.18％、カタールのSamawiら16では呼吸器感染からA. baumanniiが48.9％と報告されています。 本研究では，年齢が65歳以上の男性に多く，また，本菌は高年齢層や重症のICU患者を好むため，MDR菌はICU患者からの分離が多いことが示された。

本研究におけるMDR A. baumanniiの割合は91.0％と非常に高い。 また、ShresthaらとMishraらによる研究では、それぞれ約96%と95%がMDRでした。17,18 MDR A. baumanniiのこの高い有病率は、耐性遺伝子の拡散の可能性が高いことと、病院環境のどこにでも存在する能力が原因かも知れません。 MDR菌が多いA. baumannii感染症は、入院患者におけるこのような恐ろしい脅威を減らすために、広範な研究と予防策の適用がさらに必要であることを私たちに警告している。 本研究で分離された多剤耐性A. baumanniiは，カルバペネム系，アミノグリコシド系およびフルオロキノロン系の抗生物質に対して有意な耐性を示した。 MDR患者のほぼ全員がピペラシリンとセファロスポリンに耐性を示し，ゲンタマイシンに93.8％，メロペネムに89.4％と，同じ病院のMishraら18の報告（セファロスポリンとカルバペネムにそれぞれ約89％と50％が耐性）より高い耐性を示した。 2007年のMYSTIC（Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection）プログラムでは，ヨーロッパではメロペネムに74.1％，イミペネムに78.9％が感受性を示したが，アジア諸国では51.3％と52.0％とかなり低い感受性の結果となった20，21）。また，高アミノ酸塩耐性株の出現が増加していることも懸念される． 本研究では，MDR A. baumanniiの95.0％がciprofloxacinに，88.2％がlevofloxacinに耐性を有していた。 フルオロキノロン系抗菌薬は広域抗菌薬として臨床医療で広く使用されていることから，近年，臨床分離株で耐性が急速に増加している。 しかし，Josephら22およびAl-Sweihら23の研究では，Acinetobacter属菌の硫酸コリスチン耐性はそれぞれ20％および12％であり，MDR A. baumanniiに対するポリミキシンBおよびコリスチン硫酸は優れた効果を示していることが明らかとなった。 しかし，本研究では，一般的に使用されている抗生物質に対して高い耐性率を示しており，ネパールのような国の医療制度にとって，患者管理に大きく影響するデメリットである。 これは、病院内での抗菌薬の使用頻度が高いこと、病院外でも簡単に入手でき、無差別に使用されていること、また、多くの抗菌薬がセルフメディケーションのために市販されていることが原因であると思われる。

第3世代および第4世代セファロスポリンに対するA. baumanniiの感受性低下は，ESBLまたはAmpC β-ラクタマーゼ産生菌，あるいはその他の関連する基礎的メカニズムに起因している可能性がある． 本研究では，MDR A. baumanniiの19.9％がESBL産生菌であることを明らかにした。 Mishraらの研究18では，ESBL産生菌はAcinetobacter属の12.9％のみであった． インドの研究25では、A. baumanniiの7％のみがESBL産生菌であったが、インドの別の研究8では、Acinetobacter spp.の29.9％がESBL産生菌であったことが記録されている。 研究により、院内および市中からの分離株における ESBL の有病率は、国や施設によって異なることが明らかになっています。 これは、抗生物質の処方習慣やESBL産生遺伝子を保有する病原体の存在に起因していると考えられる。 AmpCβ-lactamases産生菌の検出に関するCLSIガイドラインはないが，我々はAmpCディスクテストに準拠している13）。 しかし、インドの研究では、AmpC を産生する A. baumannii の割合がより高い (56%) ことが報告されています26

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) は、世界保健機関による新薬の研究・発見・開発の指針となる、抗生物質耐性菌のグローバル優先リストの優先順位 1 (つまり重大) に含まれています27。 カルバペネム系抗生物質耐性にはさまざまなメカニズムがありますが、カルバペネマーゼ酵素の産生が最も有効なメカニズムです。9 A. baumanniiにおけるMBLの出現は、これらの酵素が高次のセファロスポリンやカルバペネムの分解につながる高い加水分解活性を有することから、治療の課題になってきているといえます。 さらに，プラスミドを介したMBL遺伝子はグラム陰性桿菌の他種に急速に拡散するため28，MBL産生を迅速に検出し，治療法を変更するとともに，拡散を防ぐ効果的な感染制御を開始することが必要である。 本研究では，メタロベータラクタマーゼ（MBL）産生株がESBL産生株やAmpC産生株よりも多く，MDR A. baumanniiの67.7％がMBL産生株であることが明らかとなった。 ネパールではMBL産生菌に関する研究は少なく，Shresthaら29は47.2％，Parajuliら24は78.8％のMBL産生菌を同一病院のAcinetobacter属菌に認めたと報告している。 Dey and Bairyの研究30では，MBLは21.7％にしか認められなかったが，複数のMBL遺伝子が菌体内に共存していることは憂慮すべき事態である。 MBL遺伝子はインテグロンと結合し、トランスポゾンに組み込まれ、さらにプラスミドに収容されるため、移動性の高い遺伝子装置となり、異なる病原体においてさらに拡散する可能性がある。 また、本研究では、KPC産生株のうち9.5％がMDR A. baumanniiであり、その一部はMBL酵素を共産していることを明らかにしようとした。 ネパールでKPCが検出されたという論文はないが，Parajuliら24は最近，ICU患者からKPC産生Acinetobacter属細菌を報告した。 カルバペネマーゼのうち，KPCはKlebsiella pneumoniaに高頻度に検出される32。β-lactamases産生菌の中には，異なるβ-lactamasesを共発生するものもあり，2種類のβ-lactamasesを生産するMDR株は高い耐性プロファイルを示している。 近年，カルバペネマーゼ産生菌の世界的な蔓延は，公衆衛生上の大きな脅威とされている。 このようにカルバペネム耐性菌が出現した後、MDR A. baumannii感染症の治療の希望は、ポリミキシンBやコリスチン硫酸などの毒性のある抗生物質による最後の手段となっています33。 現在、この状況が致命的な形になる前にコントロールすることが非常に重要になってきている。 そのため，治療を修正し，拡散を防ぐために効果的な感染制御を開始するためには，耐性決定要因を迅速に検出する必要がある。

制限事項

入院患者から十分なデータを得られなかったため，MDR A. baumannii感染の危険因子と転帰を評価することはできなかった。 さらに，耐性表現型や薬剤耐性メカニズムの遺伝子解析も決定していない。

結論

本研究から，MDR A. baumanniiによる入院患者の感染症はよくあることであることが明らかになった。 MDR菌のMBL，ESBL，AmpC産生率は非常に上昇しており，この菌は高い罹患率と死亡率をもたらす可能性があり，コリスチン硫酸やポリミキシンBなどの毒性のある抗生物質で治療するしかなく，入院患者にとっては悩ましい問題である。 病原体における薬剤耐性の適切な検出、広域抗生物質の過剰使用を避けるための抗菌薬制限政策、耐性監視システムの改善、厳格な感染管理対策などの確立された提言が、この状況をコントロールするのに役立つことでしょう。