- 実験動物
- 組織学的解析
- 単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション（smFISH）
- 増殖LECsのEdU取り込みアッセイ
- 電子顕微鏡検査
- 固有層からの脂質クリアランスの生体内イメージング
- 脂質吸収試験
- 抗体の処理
- 小腸からのLEC富化とIntSC分離
- マウスIntSCsの一次培養
- フローサイトメトリーとセルソーティング
- バルクRNA-シークエンス
- MEFとHDLEC
- スフェロイドによる発芽アッセイ
- 定量的RT-PCR
- In vitro stretch and osmotic experiments
- Ex vivo浸透圧実験
- MEFの免疫蛍光染色
- ChIP-qPCR
- ELISA
- 形態計測
- ドロップレットベースの単一細胞RNAシーケンス
- 単細胞RNAデータの前処理
- 変動遺伝子の同定と次元削減
- クラスタ解析
- 遺伝子オントロジーエンリッチメント解析
- 統計
- Reporting summary
実験動物
すべての動物飼育と実験手順は、施設動物飼育・使用委員会の承認のもと、動物研究および試験についての倫理規定を遵守しています（No． KA2016-12） of Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)の承認のもと、動物研究および試験に関するすべての倫理規定を遵守した。 Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 および Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 のマウスは、KAIST の特定病原体フリー（SPF）動物施設で移植、確立、繁殖させたものである。 C57BL/6 J、R26-tdTomato および Myh11-Cre-ERT2 マウスは、Jackson Laboratory から購入した。 すべてのマウスはC57BL/6バックグラウンドで維持され、標準食（PMI LabDiet）と水を自由に摂取できるようにした。 Cre-ERT2マウスにCre活性を誘導するために、コーン油（Sigma-Aldrich）に溶解した2mgのタモキシフェン（Sigma-Aldrich）を、各実験について示された時点で腹腔内（i.p.）に注射した。 同腹子のうちCre-ERT2陰性だがflox/flox陽性のマウスを各実験の対照（WT）マウスと定義した。
組織学的解析
小腸のホールマウント染色は、麻酔後に2％パラホルムアルデヒド（PFA）で経心灌流を行った。 小腸を摘出し、縦に切断して内腔を露出させた。 PBSで数回洗浄した後、腸をシリコンプレート上に固定した。 サンプルはPBSで数回洗浄した後、PBS中10%スクロースで2時間、PBS中20%スクロース、10%グリセロールで一晩脱水した。 耳の皮膚、気管および横隔膜は、経心灌流せずに採取し、4％PFAで4℃、1時間固定した。 サンプルはブロッキングの前にPBSで数回洗浄した。 0.5% Triton-X 100 in PBS (PBST)中の5%ヤギまたはロバ血清で1時間ブロッキングした後、サンプルをブロッキング溶液で希釈した指示一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。 PBSTで数回洗浄した後、サンプルをブロッキング緩衝液で希釈した指示されたフルオロクロム標識二次抗体とともに室温（RT）で2時間インキュベートした。 サンプルをPBSTで洗浄し、核をDAPI（Invitrogen）により染色した。 PBSで洗浄後、サンプルをVecta-shield (Vector Laboratories)でマウントした。 画像は、Zeiss LSM 800またはLSM 880共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）を使用して得た。
免疫染色には、以下の一次抗体および二次抗体を用いた：抗LYVE-1（ウサギポリクローナル、11-034、Angiobio、1：400）；抗CD31（ラットモノクローナル、557355、BD Biosciences、1:400）；抗CD31（ハムスターモノクローナル、MAB1398Z、Merck、1：400）；抗E-カドヘリン（ヤギポリクローナル、AF748、R&D, 1：200）；抗Prox1（ヤギポリクローナル、AF2727、R&D, 1:400）；抗Prox1（ウサギポリクローナル、102-PA32AG、ReliaTech、1：400）；抗VE-カドヘリン（ヤギポリクローナル、AF1002、R&D, 1：200）；抗PDGFRβ（ラットモノクローナル、 ab91066, Abcam、1:200）；抗PAI-1（マウスモノクローナル、sc-5297、Santa Cruz、1：100）；抗Serpina3n（ヤギポリクローナル、AF4709、R&D, 1：200）；抗Fosb（ウサギモノクローナル、2251、Cell Signaling Technology、1:400）；抗Shisa3（ウサギポリクローナル、TA320118、Origene、1：400）；抗P2X1（ウサギポリクローナル、APR-001、Alomone labs、1：800）；抗Ackr4（ウサギポリクローナル、SAB4502137、Sigma-Aldrich、1:200）；抗Grem1（ヤギポリクローナル、AF956、R&D, 1：200）；抗Sox6（ウサギポリクローナル、ab30455, Abcam, 1：400）；抗PDGFRα（ヤギポリクローナル、AF1062、R&D, 1:200）；抗YAP（ウサギモノクローナル、14074、Cell signaling、1：200）；抗TAZ（ウサギポリクローナル、HPA007415、Sigma-Aldrich、1：200）；抗αSMA、フルオレッセインイソチオシアナート（FITC）-標識（マウスモノクローン、F3777、Sigma-Aldrich、1:1000）；抗VEGFR3（ヤギポリクローナル、AF743、R&D, 1：200）；抗VEGFR2（ヤギポリクローナル、AF644、R&D, 1：200）；抗PGP9.SMA（ヤギポリクローナル、AF743、RD, 1：2005（ウサギモノクローナル、13179、Cell signaling、1：400）；抗F4／80、FITC標識（ラットモノクローナル、1231007、Biolegend、1：200）；抗CD3（ハムスターモノクローナル、553058、BD Biosciences、1：1000）；抗デスミン（ウサギポリクローナル、AB907、Millipore、1．Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-conjugated anti-rabbit, anti-rat, anti-goat, anti-hamster secondary antibodies (diluted at the ratio of 1:1000) was purchased from Jackson ImmunoResearch.
単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション（smFISH）
小腸のsmFISHでは、麻酔後に2％PFAで経心筋灌流を行った。 サンプルは4%PFAで4℃、2時間後固定した。サンプルはPBSで数回洗浄し、30%スクロースに移し、一晩インキュベートした。 OCTに埋め込んだサンプルを切片化し、RNAscope Fluorescent Multiplex Assay kit (320850, ACDBio)に記載されている製造業者のプロトコルにしたがって、smFISHを実施した。 smFISHには、RNA scope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2)を用いた。 smFISHによる免疫染色では、以下の一次抗体および二次抗体を用いた。 抗PDGFRβ（ラットモノクローナル、ab91066、Abcam）；抗Shisa3（ウサギポリクローナル、TA320118、Origen）；抗P2X1（ウサギポリクローナル、APR-001、Alomone labs）およびAlexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647コンジュゲート二次抗体をJackson ImmunoResearchから購入した。 画像は、Zeiss LSM 800またはLSM 880共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて得た。
増殖LECsのEdU取り込みアッセイ
乳汁中の増殖LECを検出するために、5mgの5-ethynyl-2´deoxyuridine (EdU, A10044, Invitrogen）をストック液として1mlのミリQ水に溶かし、このストック液は、乳汁中の増殖するLECsを検出するために、1mlのミリQ水（Milli-Q water）中で溶解した。 そして、解析前の1週間、マウス1匹あたり200μlのストック溶液を隔日でi.p.注射した。 小腸を分離し、上記と同様に処理した。
電子顕微鏡検査
乳腺の超微細電子顕微鏡画像を撮影するために、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）中の4％PFAと0.25％グルタルアルデヒドで経心灌流した後に小腸を切片化した。 その後、2.5%グルタルアルデヒドで一晩固定し、1%四酸化オスミウムで後固定し、濃度を上げた一連のエタノールで脱水した後、樹脂包埋を行った。 超ミクロトーム（UltraCut-UCT, Leica）を用いて70 nmの超薄切片を得、これを銅グリッド上に回収した。
固有層からの脂質クリアランスの生体内イメージング
マウスは処置の12時間前に食物を除去し、麻酔をかけた。 イントラビタルイメージングは、我々が以前に記述したように実施された34。 簡単に言うと、BODIPY脂質プローブ（0.1mg/ml、Thermo Fisher）を2.5％DMSO溶液（Sigma-Aldrich）に溶解した。 乳管を蛍光標識するために、Alexa Fluor 647（Invitrogen）抗体を結合した抗LYVE-1（ラットモノクローナル、223322、R&D）（0.75 mg/kg）を撮影の12時間前に静脈内注入した。 その後、近位空腸を37℃に保たれたイメージングチャンバーに収容し、撮影を行った。 腸管内腔を抗腸間膜境界線に沿って1.5 cm開口した後、絨毛を観察するために露出した内腔にカバーグラスを置いた。 イントラビタルイメージングは3回にわたって行われた。 絨毛はまずBODIPY-FA供給前の0分に撮像した。 次に、2回目のイメージングセッションの前に30μlのBODIPY脂質プローブを1回供給し、1分での最初のBODIPY脂質吸収を観察した。 次に、26分からの3回目の撮像の前に2分間隔で3回BODIPY脂質を供給し、36分と46分に乳頭を通過するBODIPY-FAのクリアランスを解析した。 自作のビデオレートレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用した34。 蛍光イメージングの励起源として，488 nm（MLD，コヒレント社製）と640 nm（Cube，コヒレント社製）の2つの連続波レーザーを使用した． 蛍光信号の検出には2つのバンドパスフィルター（FF01-525/50およびFF01-685/40，Semrock）を使用した． 4μm以下の軸分解能は100μmのピンホールと60倍の対物レンズ（LUMFLN，水浸，NA 1.1，オリンパス）を用いて取得した。 画像（512×512ピクセル）は、フレームレート30Hzで取得した。 画像のS/N比向上のため，リアルタイム画像（30フレーム/秒）を後処理した後の90フレーム以上のノイズを，カスタムライティングしたMATLABプログラムで蠕動運動から生じるモーションアーチファクトを除去し平均化した．
脂質吸収試験
12時間の食物除去の後、血漿トリグリセリド測定およびオイルレッドO染色のために、200μlのオリーブオイル（シグマ・アルドリッチ）を経口投与した。 オリーブオイル投与後0、1、2、3、4時間に尾静脈からヘパリン入り採血管に採血した。 血漿中のトリグリセリド濃度はVetTest Chemistry analyzer（IDEXX Lab社製）を用いて測定した。 オイルレッドO染色キット（MAK194、Sigma-Aldrich）の製造元のプロトコールに従い、オリーブオイル投与後12時間に小腸をオイルレッドOで染色した。 高脂肪食（HFD）（脂肪分60％、Research Diets、D12492）の給与を12週齢から開始し、8週間継続して血漿トリグリセリド測定とOil Red O染色を行った。 血液は6時間絶食後、尾静脈からヘパリン入り採血管に採血した。 肝切片のオイルレッドO染色は、採取した肝臓を4％PFAで一晩4℃で固定し、100μmのビブラトーム切片（ライカ、VT1200S）に切り出し、オイルレッドOで染色した。 IgG Fcドメインに融合したVEGFR3のリガンド結合ドメイン1〜4をコードする組換えAAV（AAV-mVEGFR31-4-Ig）の投与（150〜200μl中1012ウイルス粒子）、および対照マウスは、以前に記載したように37、VEGF-CまたはVEGF-Dに結合しないVEGFR3のドメイン4〜7をコードするAAV（AAV-mVEGFR34-7-Ig）をIgG Fcドメインに融合して同じ量を投与された。 AAV-mVEGFR31-4-IgおよびAAV-mVEGFR34-7-Igは、血清中のイムノブロッティング分析（抗VEGFR3抗体；ヤギポリクローナル、AF743、R&D) により0.5μlを腸内分析同日に採取した血清試料を用いた。
抗体の処理
VEGFR2遮断には、VEGFR2中和抗体（DC101）を使用した。 DC101を産生するハイブリドーマ細胞株をAmerican Type Culture Collection (ATCC)から購入した。 ハイブリドーマ細胞は、無血清培地で培養した。 上清中の組換えタンパク質は、プロテインAアガロースゲル（Oncogene社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。 精製後、ブラッドフォードアッセイを用いて組換えタンパク質を定量し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）後にクマシーブルー染色で確認した。 DC101（50mg/kg）または同量のコントロール抗体（IgG-Fc、SAB3700546、Sigma-Aldrich）を、2週間にわたり2日ごとに標記マウスにi.p.注射した。
小腸からのLEC富化とIntSC分離
小腸から血清、筋肉層および腸間膜脂肪組織を除去した。 腸管片を縦に開き、PBSで洗浄後、サンプルを2cmに切り、パイエル板を除去した。 サンプルをPBSで洗浄し、カルシウムとマグネシウムを含まないDMEM（Gibco）を加えた10mM EDTAで20分間氷上でインキュベートした。 組織は、上皮細胞のない透明な上清を得るまで、カルシウムフリーのPBSでボルテックスした。 サンプル片をさらに1 mmの断片に切断し、DMEM中2 mg/ml コラゲナーゼII（Worthington）、1 mg/ml Dispase（Gibco）、および1 U/ml DNase（Invitrogen）を含む解離バッファで37℃、30分間解離させた。 解離を助けるために、10分ごとに組織片を静かに上下にピペッティングした。 その後、サンプルを70μmのストレーナーで濾過し、残った腸管片を機械的に解離させた。 上清を回収した後、10％ウシ胎児血清（FBS）を含む等量のDMEMを加えた。 遠心分離後、細胞をPBSに再懸濁した。 ストローマ細胞画分とLECを濃縮するため、抗CD45および抗CD326 Microbeads（Miltenyi）と氷上で15分間インキュベートした後、AutoMACS（Miltenyi）を用いて造血細胞および上皮細胞を枯渇させた。 IntSCの単離には、抗CD45および抗CD326 Microbeadsに加えて、内皮細胞を枯渇させるために抗CD31 Microbeads（Miltenyi）を加えた。
マウスIntSCsの一次培養
IntSCs単離後、細胞を組織培養プレート上で10％FBS含有DMEM/F12を用いて24時間または2日間培養を実施した。 薬物処理および免疫蛍光染色のために、1ウェルあたり50,000個の細胞を4ウェルNunc Lab-Tek IIチャンバースライド（Sigma-Aldrich）にプレーティングした。 薬物濃度は図示の凡例に記載されており、免疫蛍光および遺伝子発現解析のための処理は6時間持続した。 WT マウスまたは Yap/Tazi∆FRC マウス由来の初代培養 IntSCs における cre 活 性の誘導のために、細胞を 5 µM の 4-ヒドロキシタモキシフェン (4-OHT) と 100%エタノール (EtOH) または 100% EtOH 単独 で 2 日間処理し、コントロールとして、Elastically Supported Surface (Ibidi) 付き 35 mmイメージングディッシュを使用し た。 PDGFRβ+として検証されたIntSCsの培養拡大単層を実験に使用した。
フローサイトメトリーとセルソーティング
PDGFRβ+IntSCsまたは腸LECを選別するために、濃縮画分はACK溶解バッファ（Gibco）中に懸濁してRBC溶解に進み、5分間、RTで行った。 マウス抗CD16/CD32（553141、BD Bioscience）でFcγ受容体をブロックした後、細胞をFACS緩衝液（PBS中2％FBS）中指示抗体と15分間インキュベートした。 数回の洗浄後、細胞をFACS Canto II（BD Biosciences）で解析し、取得したデータをさらにFlowJoソフトウェア（Treestar）を使用して評価した。 細胞のソーティングはFACS Aria Fusion (Beckton Dickinson)で行った。 死細胞はDAPI（Sigma-Aldrich）染色を用いて除外し、細胞二重鎖は系統的に除外した。 蛍光強度は対数スケールで任意の単位で表し、前方散乱と側方散乱はリニアスケールで表した。 フローサイトメトリーには以下の抗体を使用した。 FITC抗マウスCD45（11-0451-85、ラットモノクローナル、Biolegend）；FITC抗マウスTER-119（11-5921-85、ラットモノクローナル、Biolegend）；APC抗マウスCD31（551262、ラットモノクローナル、BD Bioscience）；およびPE/Cy7抗マウスポドプラニン（127412、シリアンハムスターモノクローナル、Biolegend）。
バルクRNA-シークエンス
分離したPDGFRβ+ IntSCsのバルクRNA-シークエンスは、アライメントファイルを入手することにより実施した。 簡単に言うと、リードはTopHatソフトウェアツールを使ってマッピングされた。 アラインメントファイルは、転写産物のアセンブル、それらの存在量の推定、およびカフリンクを用いた遺伝子またはアイソフォームの発現差の検出に使用された。 Ingenuity Pathway Analysisツール（QIAGEN）を用いて、canonicalシグナル伝達の文脈でデータをさらに評価し、YAP/TAZ-hyperactivated遺伝子が分泌分子に特異的に関連しているかどうかを決定した。 canonicalシグナルの有意性は、多重比較を補正するためにP値を調整するBenjamini-Hochberg手順によって検証し、それらの活性化または阻害は活性化zスコアを参照して決定した。 クラスター解析とヒートマップはMorpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/) を用いて作成した。 GSEAについては、Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/) からの遺伝子セットコレクションを用いた。
MEFとHDLEC
マウス胚性線維芽細胞（MEF）は以前に記載したようにE12.5胚から分離された32． 簡単に言うと、頭部、四肢、心臓の組織を取り除き、サンプルをハサミでミンチにして、DNase（1U/ml、Invitrogen）を加えた0.1%トリプシン/EDTAで37℃、20分間消化した。 消化し、未消化の組織を除去した後、細胞を短時間スピンさせ、10cmディッシュにプレーティングし、サブコンフルエンスまで成長させた。 その後、MEFは10%FBSを含むDMEM/F12で維持した。 ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（HDLEC）はLonzaから購入し、内皮増殖培地（EGM2-MV、Lonza）中で培養した。 MEFsとHDLECsは、継代2または3のものを使用した。 細胞は5％CO2の加湿雰囲気中、37℃で培養し、マイコプラズマ陰性であることを確認した（MycoAlert Detection Kit, Lonza）。
スフェロイドによる発芽アッセイ
LECスフェロイドは、0.25％メチルセルロース含有培養液中で継代数2または3のHDLECを培養して、垂下滴として一晩インキュベートして生成させた36。 その後、スフェロイドを回収し、2mg／mlのコラーゲンタイプI（コーニング）に埋め込み、コントロールのウシ血清アルブミン（BSA、シグマ・アルドリッチ）、WISP2（300ng／ml、ペプロテック）、TNFSF15（50ng／ml、ペプロテック）、BDNF（50ng／ml, Peprotech）、EBI3（100ng/ml、Peprotech）またはANGPT2（5μg/ml、自社製）、VEGF-C（200ng/ml、R&D Systems）入り、1% FBS含有内皮細胞基底液（PromoCell）中で24時間使用した。 インキュベーションの最後に、スフェロイドをセルトラッカー（Molecular Probes, 1.5 μM, 37 ℃, 30 min）で染色した。
定量的RT-PCR
RNAは、RNeasy Microキット（Qiagen）またはTrizol RNA抽出キット（Invitrogen）を使用して抽出されました。 抽出したRNAの合計1μgをGoScript Reverse Transcription Kit (Promega)を用いてcDNAに転写した。 定量的リアルタイムPCRはFastStart SYBR Green Master mix (Roche) とS1000 Thermocycler (Bio-Rad) を用いて、指示されたプライマーを用いて実施した。 プライマーはPrimer-BLASTを使用して設計、または既報の研究から採用し、補足表1に記載した。 Gapdhは参照遺伝子として使用し、結果はコントロールに対する相対発現として示した。 プライマー反応の特異性は融解曲線解析により確認した。 相対的な遺伝子発現は、CFX Managerソフトウェア（Bio-Rad）を用いてΔΔCt法により解析した。
In vitro stretch and osmotic experiments
MEFsおよびプライマリーマウスIntSCsは、機械的細胞伸展装置（STREX）を用いて10サイクル/分で4%の直線伸展を行い、浸透圧は、以前に記載したとおり0.4Mソルビトールを3時間かけた40，50．
Ex vivo浸透圧実験
麻酔下で腹腔を開いた後、小腸の空腸部分を2cmに切り分けた。 腸片は縦に開き、PBSで洗浄した。 組織は5%FBSを含むDMEM/F12で培養し、すぐに0.4Mソルビトールで3時間浸透圧ストレスを与えた。
MEFの免疫蛍光染色
MEFを8ウェルのNunc Lab-Tek IIチャンバースライド（シグマ・アルドリッチ）にプレーティングし、4％パラホルムアルデヒドで4℃、15分間固定した。 PBSで数回洗浄後、0.5%PBST中の5%ヤギ（またはロバ）血清で30分間RTでブロッキングした。 細胞を、示された一次抗体とともに、4℃で一晩インキュベートした。 結合した一次抗体は、二次抗体と90分間RTでインキュベートすることにより検出した。 以下の一次抗体を細胞染色に使用した：抗YAP（ウサギモノクローナル、14074、Cell signaling）；抗TAZ（ウサギポリクローナル、HPA007415、Sigma-Aldrich）；およびAlexa Fluor 488標識抗phalloidin（A12379、Thermo Fisher）抗体。 Alexa Fluor 594標識二次抗体はJackson ImmunoResearchから購入した．
ChIP-qPCR
MEFを1%PFAで10分間固定し、グリシンでクエンチした。 サンプルはPBSで洗浄し、1%SDSを含む溶解バッファーで溶解させた。 細胞溶解液中の固定DNAはFocused-ultrasonicator (Covaris)を用いて超音波処理した。 細胞溶解液を遠心分離し、得られた上清のうち5%（全細胞溶解液入力コントロール用に保存）を除くすべてを、0.5% Triton X-100を含むChIP希釈バッファーで希釈した。 次に、希釈したサンプルを抗TEAD4抗体（マウスモノクローナル、ab58310、Abcam）と共に4℃で一晩インキュベートした。 その後、プロテインA/G Dynabeads (Thermo Fisher) を加え、4 ℃で2時間インキュベートした。 ビーズをDynaMag-2 (Thermo Fisher) で分離し、一連のChIP洗浄バッファ（低塩洗浄バッファ、高塩洗浄バッファ、LiCl洗浄バッファ、TEバッファ）で洗浄した。 サンプルは1% SDSで65℃、各15分間、2回溶出した。 ビーズを除去し、溶出物と5%全細胞ライセート入力サンプルの両方を65℃で一晩逆架橋した。 pHを正常化した後、サンプルをRNase (3 μg/mL) とともに37℃で30分間、プロテイナーゼK (20 mg/ml) とグリコーゲン (20 mg/ml) とともに55℃で2時間インキュベートした。 DNAは標準的な手順で溶出し、ChIP-DNAは補足表2に記載したプライマーを用いて入力サンプルと比較してqPCRで分析した。
ELISA
初代培養マウスIntSCsの上清を伸展後に採取し、上清を15分間遠心分離した。 上清中のVEGF-C濃度は、マウスVEGF-C特異的ELISAキット（CSB-E07361m、クサビオ）を用いた酵素結合免疫吸着法（ELISA）により測定した。
形態計測
形態計測にはImageJソフトウェア（NIH）、ZEN 2012ソフトウェア（カールツァイス）、Imaris（ビットプレーン）などを使用した。 乳頭表面積の定量化には、解析する画像に閾値を設定し、絨毛内の各乳頭について絶対的な絨毛LYVE-1+面積を計測した。 腸の指示された部分の各ランダム850μm2フィールドの絨毛E-cadherin+またはCD31+またはLYVE-1+免疫染色の画像を用いて、絶対乳汁長、絶対絨毛長および絶対絨毛幅を測定した。 乳腺と絨毛の表面積、長さ、幅の測定には、小腸全体で少なくとも100本の絨毛を分析した。 小腸の以下のパラメータは空腸で計測した。 乳頭萌芽数と乳頭分岐数は、10-20個のランダムなLYVE-1+乳頭で測定した。 10-20個のLYVE-1+乳頭の長さ100μm以内のProx1+ LECsの数およびProx1+EdU+ LECsの数を手作業でカウントした。 乳頭のVE-cadherin+接合部の定量は、マウス1匹につき5-10絨毛の乳頭を対象に40倍の対物レンズで実施した。 簡単に言うと、ジッパー型接合は、細長い形状をした細胞で、細胞と細胞の境界で連続的に接合しているものと定義された51。 ボタン状接合は、細胞-細胞境界と平行でない不連続な接合で、柏の葉のような細胞の形をしているものと定義された。 どちらのパターンにも合致しない接合は，混合型に分類された。 BODIPYの蛍光強度（FI）およびその定量化は、既報の通り行った34。 オイルレッドO面積はオイルレッドO+面積を絨毛面積で除して測定し、コントロールマウスの平均値で正規化した。 絨毛平滑筋細胞被覆面積は、1サンプルあたり850μm2の5フィールドにおける絶対αSMA+被覆面積として測定し、これをコントロールマウスのものの平均値で正規化した。 乳腺VEGFR3の相対的発現を定量化するために、1サンプルあたり5つの425μm2フィールドで測定した平均FIを、そのコントロールで割った相対値として示した。 血管密度を測定するために、VEGFR2の面積を1サンプルあたり5つの425μm2フィールドで測定し、そのコントロールに対する相対値として提示した。 CD3+ T細胞またはF4/80+マクロファージの面積は、1検体あたり5つの425 µm2フィールドで測定した。
ドロップレットベースの単一細胞RNAシーケンス
選別された単一細胞は、10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) を用いてメーカーのプロトコルに従い処理された。 簡単に説明すると、ソートされた細胞を0.5%BSAを含むPBSに再懸濁し、RT reagent mixとRT primerと混合し、10Xチップの各チャンネルに5000細胞を目標に添加した。 細胞はGel Beads in Emulsionに分離され、そこで単一細胞からのRNA転写物がバーコード化され、逆転写された。 cDNAライブラリーの構築と増幅後、cDNA分子を酵素で断片化し、末端を修復してA-tailした。 SPRIビーズ(Beckman Coulter)を用いた二重サイズ選択により、処理したcDNA分子の適切なサイズを選択した後、アダプターでライゲーションし、サンプルインデックスPCRを実施した。 さらにSPRIビーズで2倍のサイズ選択を行った後、最終的なライブラリーコンストラクトを10倍に希釈し、Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chipで品質管理した。
単細胞RNAデータの前処理
生のシーケンスデータは、まず10X GenomicsのCell Ranger 3.0.2 toolkit (http://10xgenomics.com) によって多重化解除されマウス参照ゲノム（mm10）にマッピングされた。 Rパッケージ Seurat (version 3.0.0)52 を用いて、Read10X関数で生の発現マトリクスを構築した。 検出された遺伝子が1000個未満、または6000個以上の細胞（潜在的なダブレットと考えられる）は除外された（補足図17a）。 また、ミトコンドリア遺伝子に関連するユニーク分子識別子（UMI）数が多い細胞（>7% of total）は死滅細胞とみなし、除外された。 遺伝子については、3細胞未満で発現しているものを除外した。 また、Ptprc+免疫細胞やPecam1+Cdh5+内皮細胞は、最初のクラスタリングで少数が混入していたため、除外した。 不要な細胞や遺伝子を除去した後、ある細胞の各遺伝子のUMIカウントをその細胞の総発現量で割り、10,000倍して対数変換を行った。
変動遺伝子の同定と次元削減
RパッケージのSeuratをクラスタリング解析に使用した。 まず、SeuratのFindVariableFeatures関数で、selection.method = “vst “のオプションで、データセット全体の高変動遺伝子を同定した。 変動性の高い上位2000遺伝子を選択し、下流解析を行った。 また、この遺伝子群を用いて、主成分分析(PCA)による次元削減を行った。 PCA スコアの統計的有意性を判断するために JackStraw 関数を使用した。
クラスタ解析
転写プロファイルによって細胞をクラスタリングするために、我々は4つのサンプルすべてについて、上位2000の高変動遺伝子について教師なしクラスタリングを行った。 まず、FindNeighbors関数を用いて主成分空間上に共有最近傍（SNN）グラフを構築した。 次に、FindClusters関数を用いて、モジュール性最適化に基づくクラスタリングのためのlouvainアルゴリズムを適用した。 クラスタリング分解能のパラメータは、クラスタが非常に異なる転写プロファイルを示す点に設定した。 クラスタリングは、細胞あたり検出された遺伝子数に依存しなかった（補足図17b）。 クラスター特異的マーカーは、SeuratのFindMarkers機能で同定した各クラスターの差分発現遺伝子で、min.pct = 0.3, logfc.threshold = 0.25, min.diff.pct = 0.15,test.use = “MAST “の設定であった。 修正P < 0.05で同定されたマーカーがさらなる解析に使用された。 平滑筋細胞や壁細胞などの一部の細胞種はよく知られたマーカーを持つため、各クラスターのマーカーリストの上位に表示され、マーカー選択プロセスが検証された。 性別などの不要な変動要因を除去するため、細胞を女性特異的転写物Xistの存在によって分割し、統合した。 異なるデータセットを統合するために、まず、それぞれの生の発現行列を対数正規化し、各データセットの上位2000個の変動性の高い遺伝子を特定しました。 次に、SeuratのFindIntegrationAnchors関数を用いて、データセット間のアンカーを特定しました。 次に、Seurat の IntegrateData 関数を用いて、特定したアンカーを基にデータセットを統合した。 統合されたデータセットは、さらにクラスター分析を行うために、スケーリングされ、次元が削減された。
遺伝子オントロジーエンリッチメント解析
クラスターマーカーの遺伝子オントロジーエンリッチメント解析は、Rパッケージgoseq（バージョン1.34.0）53を用いて実施された。 遺伝子の長さに応じて、各遺伝子の重み付けを求め、Wallenius近似を用いて、関連する遺伝子オントロジー用語を同定した。 Gene ontology terms that have adjusted P < 0.05 and biological process categories were selected.
統計
サンプルサイズを事前に決定するための統計手法は使用されていない。 実験は無作為化され、研究者は実験と結果解析の間、割り当てについて盲検化された。 すべての値は、平均±標準偏差（SD）として提示されています。 統計的有意性は、2群間の両側Mann-Whitney U検定、または多群間比較のためのHolm-Sidakの多重比較検定を伴う二元配置分散分析によって決定された。 統計解析はGraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software)を用いて行った。 Statistical significance was set at P < 0.05.
Reporting summary
Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.