Antes da disponibilidade de computadores, a determinação dos valores de KM e Vmax requer a manipulação algébrica da equação básica de Michaelis-Menten. Como Vmax é abordado assimmptoticamente (ver Figura 8.11), é impossível obter um valor definitivo a partir de um gráfico típico de Michaelis-Menten. Como KM é a concentração do substrato em Vmax/2, é igualmente impossível determinar um valor exato de KM. No entanto, Vmax pode ser determinado com precisão se a equação de Michaelis-Menten for transformada em uma que dê uma trama em linha reta. Tomando o recíproco dos dois lados da equação 23 dá
Um gráfico de 1/V0 versus 1/, chamado Lineweaver-Burk ou gráfico duplo-recíproco, produz uma linha reta com uma intercepção de 1/Vmax e uma inclinação de KM/Vmax (Figura 8.36). A intercepção no eixo x é -1/KM.
Figure 8.36
A Double-Reciprocal ou Lineweaver-Burk Plot. Um gráfico duplo recíproco de cinética enzimática é gerado pelo gráfico 1/V0 como função 1/. A inclinação é o KM/Vmax, a intercepção no eixo vertical é 1/Vmax, e a intercepção no eixo horizontal (mais…)
Gráficos duplos recíprocos são especialmente úteis para distinguir entre inibidores competitivos e não competitivos. Na inibição competitiva, a intercepção no eixo y do gráfico de 1/V0 versus 1/ é a mesma na presença e na ausência do inibidor, embora a inclinação seja aumentada (Figura 8.37). Que a intercepção é inalterada é porque um inibidor competitivo não altera o Vmax. Em uma concentração suficientemente alta, praticamente todos os locais ativos são preenchidos por substrato, e a enzima está totalmente operativa. O aumento na inclinação da parcela 1/V0 versus 1/ indica a força de ligação do inibidor competitivo. Na presença de um inibidor competitivo, a equação 31 é substituída por
in que é a concentração de inibidor e Ki é a constante de dissociação do complexo enzima-inibidor.
Figure 8.37
Inibição Competitiva Ilustrada em um Lote Duplo-Reciprocal. Um gráfico duplo-reciprocal da cinética enzimática na presença (
)e ausência (
) de um inibidor competitivo ilustra que o inibidor não tem efeito sobre o Vmax mas aumenta o KM.
Em outras palavras, a inclinação da trama é aumentada pelo fator (1 + /Ki) na presença de um inibidor competitivo. Considere uma enzima com um KM de 10-4 M. Na ausência do inibidor, V0 = Vmax/2 quando = 10-4 M. Na presença de 2 × 10-3 M inibidor competitivo que está ligado à enzima com um Ki de 10-3 M, o KM aparente (KappM ) será igual a KM × (1 + /Ki), ou 3 × 10-4 M. A substituição destes valores na equação 23 dá V0 = Vmax/4, quando = 10-4 M. A presença do inibidor competitivo corta assim a taxa de reação pela metade a esta concentração do substrato.
Na inibição não competitiva (Figura 8.38), o inibidor pode combinar com a enzima ou com o complexo enzimático-substrato. Na inibição não competitiva pura, os valores das constantes de dissociação do inibidor e da enzima e do inibidor e do complexo enzimático-substrato são iguais (Seção 8.5.1). O valor de Vmax é diminuído para um novo valor chamado Vappmax, e assim a intercepção no eixo vertical é aumentada. A nova inclinação, que é igual a KM/Vappmax, é maior pelo mesmo fator. Em contraste com Vmax, KM não é afetado por pura inibição não competitiva. A velocidade máxima na presença de um inibidor não-competitivo puro, Vimax, é dada por
Figure 8.38
Inibição Não-Competitiva Ilustrada em Plot Duplo-Reciprocal. Um gráfico duplo-reciprocal da cinética enzimática na presença (
) e ausência (
) de um inibidor não-competitivo mostra que o KM não está alterado e o Vmax está diminuído.