1 Teoria
Oligonucleotídeos são sintetizados pela adição de uma base de cada vez, estendendo-se do 3′ ao final do 5′, anexado a um suporte de fase sólida. Quando a síntese química do oligonucleotídeo está completa, a cadeia de DNA é liberada do suporte sólido através da incubação com hidróxido de amônio. O amônio também atua como agente desprotetor, separando os grupos que protegem os fosfatos nas ligações fosfodiéster. Depois disso, amônia quente é adicionada para hidrolisar os grupos protetores dos grupos de aminoácidos exóciclicos de desoxiadenosina, desoxicitosina e desoxiganosina. O oligonucleotídeo pode ser fornecido ao utilizador na solução de amoníaco como preparação bruta. Neste caso, antes do uso, pode ser necessário realizar uma etapa adicional para remover os sais e subprodutos do preparado de oligonucleotídeos gerados durante a desproteção.
Após a desproteção, o preparado de oligonucleotídeos é normalmente dessalgado, quantificado, evaporado até a secura em um liofilizador, e fornecido ao usuário na forma de pó. A solução dessalinizada de oligonucleotídeo contém o oligonucleotídeo em todo o seu comprimento, mas também contém uma mistura de produtos truncados que foram acumulados durante a síntese química. A truncagem ocorre quando a base especificada não adiciona à cadeia no ciclo correspondente (Hecker & Rill, 1998). Assim, a porcentagem de produtos truncados acumulada na preparação é determinada pela eficiência de síntese (a fração do produto completo após a síntese) e pelo comprimento da molécula. Os oligonucleotídeos longos, que requerem mais ciclos para serem sintetizados, são menos puros do que os oligonucleotídeos curtos. Estas falhas podem competir com o produto de comprimento total em algumas aplicações e podem precisar de remoção antes que o oligonucleotídeo possa ser utilizado. Entretanto, preparações de oligonucleotídeos dessalinizados são geralmente adequadas para muitas aplicações, como PCR padrão ou microarrays, especialmente se o oligonucleotídeo for < 20 nucleotídeos de comprimento.
Outra purificação para oligonucleotídeos com mais de 50 bases é recomendada porque a porcentagem de produto de comprimento total na preparação não é tipicamente superior a 80%. Para aplicações exigentes onde o comprimento exato do oligonucleotídeo é importante, tais como ensaios de mudança de gel, mutagênese dirigida ao local, sequenciamento, produção de adaptadores de clonagem ou síntese de cDNA de primeira linha para a geração de bibliotecas, a purificação adicional é recomendada, mesmo para oligonucleotídeos mais curtos (veja mais informações sobre as técnicas acima em Ensaios Padrão in vitro para Interações Ácido Proteínico-Nucleico – Ensaios de mudança de gel para RNA e Mutagênese Ligada ao DNA e Dirigida ao Local).
Purificação pode ser necessária após a síntese ou após modificação enzimática do oligonucleotídeo. Existem vários métodos para conseguir isto, e a escolha depende da natureza do oligonucleotídeo e da aplicação a que se destina.
A purificação por HPLC de fase reversa é baseada na hidrofobicidade. Utiliza uma fase estacionária não polar, e buffers aquosos e solventes orgânicos como fase móvel para eluir os analitos; os compostos polares são eluídos primeiro, enquanto os compostos não polares são retidos. Este é o melhor método para purificar oligonucleotídeos modificados com um grupo hidrofóbico, tais como biotina, etiquetas de corantes fluorescentes, ou conjugações de NHS-ester. A recuperação da massa é maior do que quando se usa a purificação PAGE e é passível de purificação de maiores quantidades de oligonucleotídeos (escala mmole), embora não remova produtos incompletos de forma tão eficaz. Os cartuchos de purificação de oligonucleotídeos, baseados na cromatografia de fase reversa, proporcionam um método rápido de dessalinização e purificação dos oligonucleotídeos.
Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) resolve os oligonucleotídeos de acordo com o seu comprimento, oferecendo assim uma resolução suficiente para diferenciar os produtos a todo o comprimento das moléculas falhadas (Atkinson e Smith, 1984). Os géis de poliacrilamida são mais eficazes para separar pequenos fragmentos de ADN do que os géis de agarose (ver Análise do RNA por electroforese analítica em gel de poliacrilamida e Electroforese em gel de agarose). A única desvantagem dos géis de poliacrilamida é que são mais difíceis de preparar e manusear do que os géis de agarose. Os géis de poliacrilamida são executados em uma configuração vertical em um campo elétrico constante. Após a eletroforese, o oligonucleotídeo é eluído do gel e concentrado, utilizando precipitação de etanol (encontrar mais sobre precipitação de ácidos nucléicos em métodos de purificação de RNA – precipitação) ou cromatografia em fase reversa. Este é o método de escolha quando a maior porcentagem de oligonucleotídeos de comprimento total é desejada para aplicações exigentes. Também é fortemente recomendado para oligonucleotídeos com mais de 30 bases. Além disso, várias amostras podem ser executadas simultaneamente e nenhum equipamento caro é necessário. A única desvantagem desta técnica é a pequena quantidade de oligonucleotídeos obtidos por purificação. Normalmente, os oligonucleótidos são utilizados na escala de 1 μmol ou menos, e a recuperação de massa após a purificação PAGE é < 50% e ainda menor no caso de oligonucleótidos modificados. No entanto, embora o rendimento seja baixo, é satisfatório para a maioria das aplicações bioquímicas.
A preparação dos oligonucleótidos é carregada num gel de poliacrilamida desnaturante a uma quantidade de pelo menos 1 mg por pista. O intervalo de resolução do gel depende da concentração de poliacrilamida. Para oligonucleotídeos curtos (de 15 a 35 bases), são recomendados géis de poliacrilamida de 13-15%; para oligonucleotídeos longos (de 35 a 70 bases), são recomendados géis de poliacrilamida de 8-13%. A percentagem do gel deve ser adaptada ao sistema de funcionamento. Normalmente usamos o sistema Bio-Rad Mini Protean II e usamos 15% de géis para purificar oligonucleotídeos de 25 bases de comprimento. Após identificação da banda correcta pela visualização UV, a banda é excisada e extraída do gel.
Dois métodos diferentes de purificação dos oligonucleótidos de géis de poliacrilamida são descritos neste capítulo. O método mais simples é a eluição por difusão. Isto é baseado no movimento das moléculas de uma região de maior concentração para uma de menor concentração. O resultado da difusão é uma mistura gradual de material. Este método é demorado, mas não requer muita mão-de-obra ou qualquer equipamento. Basicamente, a faixa de poliacrilamida contendo o oligonucleotídeo de interesse é cortada em pequenos pedaços e coberta com tampão de eluição. Após a incubação, o DNA é purificado do sobrenadante pela precipitação de etanol. O rendimento é limitado, entre 20% e 70%, dependendo do comprimento do oligonucleotídeo. Quanto maior a quantidade de tampão de eluição utilizada, mais oligonucleotídeo é difundido a partir do gel.
O segundo método é a electroeluição para uma bolsa de diálise (McDonell et al., 1977). O pedaço de gel contendo o oligonucleotídeo é excisado e colocado em uma bolsa de diálise com um tampão. A aplicação de uma corrente eléctrica faz com que o ADN migre do gel para fora do tampão do saco de diálise. O oligonucleotídeo é recuperado deste tampão e purificado. Usando este método, o oligonucleotídeo pode ser isolado com um bom rendimento, embora seja demorado se um grande número de amostras for purificado ao mesmo tempo, pois requer a inserção de cada faixa de gel em sacos de diálise individuais. Este método também funciona bem para fragmentos maiores de DNA e pode até ser usado para extrair DNA de géis de agarose.