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O cromossoma Y humano é transmitido diretamente de pai para filho durante a maior parte do seu comprimento, gerando um padrão de herança específico do sexo masculino que é distinto do resto do genoma. Os traços fenotípicos do cromossomo Y devem, portanto, ser facilmente reconhecíveis a partir de sua herança de linhagem masculina, e estudos iniciais afirmaram identificar vários desses traços, incluindo exemplos notáveis como “orelhas peludas”. No entanto, já em 1957, o exame crítico dessas afirmações não conseguiu encontrar apoio para nenhum dos 17 traços em consideração,1 uma descoberta reforçada pela análise molecular-genética subsequente das próprias “orelhas peludas”.2 Essa talvez surpreendente falta de traços cromossômicos Y pode ser entendida, pelo menos em parte, como consequência de dois fatores. Primeiro, quando uma sequência de referência para a região específica masculina do cromossoma Y humano foi gerada em 2003,3 revelou que o cromossoma carrega poucos genes e códigos específicos masculinos para apenas 23 proteínas distintas. Trabalhos posteriores descobriram que três deles estão ausentes em cerca de 2% dos homens do Sul da Ásia, cujos cromossomos Y codificam assim apenas 20 proteínas específicas de homens.4 Segundo, o cromossomo Y tem funções especializadas na determinação do sexo masculino e na fertilidade, nas quais a variação Mendeliana seria improvável de ser hereditária. Assim, no início de 2004, foi possível escrever “a análise do pedigree ainda não revelou um único gene ligado ao Y “5. No entanto, mais tarde, nesse ano, foi relatada deficiência auditiva ligada ao Y (DFNY1, MIM 400043) em uma família chinesa6 e continua sendo a única desordem Mendeliana documentada mostrando ligação em Y em humanos. Sua base, portanto, parece ser incomum e é de considerável interesse. Aqui, nós investigamos esta base examinando a seqüência do cromossomo Y DFNY1 e comparando-a com o cromossomo Y de um ramo estreitamente relacionado, mas não afetado, da família.
No pedigree DFNY1 de sete gerações relatado em 2004, todos os homens adultos foram afetados.6 Posteriormente, o pedigree foi rastreado mais duas gerações, e descendentes masculinos adicionais de um ancestral anterior foram identificados.7 Surpreendentemente, sua audição não foi afetada (Figura 1). Tínhamos previamente demonstrado a identidade dos cromossomos Y dos dois ramos da família em 67 Y-STR loci e, portanto, argumentamos que a diferença fenotípica entre os ramos deve estar associada a uma variante genética transportada especificamente pelo cromossomo Y do ramo afetado. Separamos um cromossoma Y representativo de cada ramo por citometria de fluxo e depois o sequenciamos. Apenas quatro diferenças base-substitucionais foram identificadas entre os cromossomos.8 Três delas tinham surgido no ramo não afetado. A quarta tinha surgido no ramo afetado e segregado com o fenótipo, mas forneceu um candidato pobre para a mutação causal porque estava fora de qualquer gene anotado. Embora esta análise não pudesse avaliar as regiões repetidas do cromossomo, os genes repetidos conhecidos estão envolvidos principalmente na espermatogênese,3,9 assim, no presente estudo exploramos a possibilidade de que a mutação causal possa não ser uma mutação pontual. Este estudo foi aprovado pelos doadores da amostra, que deram consentimento informado por escrito, e pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Geral PLA Chinês, Beijing, China.
O pedigree DFNY1
Homens, quadrados; mulheres, círculos; linha diagonal, falecido. Símbolos preenchidos indicam deficiência auditiva (inclusive de registros familiares); pontos de interrogação indicam dois indivíduos cujo fenótipo auditivo é desconhecido; e asteriscos indicam indivíduos que estão no ramo afetado mas que estavam abaixo da idade de início dos sintomas no momento do exame. As setas indicam os dois indivíduos cujos cromossomas Y foram sequenciados. O rearranjo estrutural ocorreu durante um dos quatro meios marcados por estrelas vermelhas. Os cônjuges são omitidos nas gerações VII-IX e na geração VI no ramo não afetado.
Examinamos a profundidade relativa de leitura ao longo do cromossomo, alinhando leituras de alta qualidade filtradas em duplicado com a seqüência de referência chrY, usando Busca de Sequência e Alinhamento pelo Algoritmo Hashing 2 (SSAHA2)10 e comparando os números de leituras por caixa de 10 kb entre os cromossomos Y do indivíduo afetado VIII-2 (Figura 1) e o indivíduo não afetado VII-24 (Figura 1). Isso revelou três segmentos descontínuos duplicados no cromossomo afetado, e todos foram derivados da região limitada entre o cluster do gene TSPY1 (MIM 480100) terminando em ∼9.3 Mb e a diferença centrômica em ∼10.1 Mb (Figura 2A). Estas duplicações foram confirmadas pela hibridização genômica comparativa oligonucleotídica convencional (CGH) com um array Agilent 1 milhão cobrindo todo o genoma e um array NimbleGen 385K personalizado abrangendo as posições chrY: 2.000.000-10.715.000 (1.990.000-10.105.000 hg19) em alta resolução (∼20 bp) (Figura 2B). Como eles incluíram parte do cluster do gene TSPY1, verificamos um aumento no número do gene TSPY1 por qPCR (Tabela S1 nos Dados Suplementares disponíveis online) e eletroforese de gel de campo pulsado (PFGE; Figura S1). Estas análises mostraram que a duplicação foi compartilhada por todos os membros da família afetados testados e estava ausente em todos os membros não afetados e também que a duplicação estava em um fragmento de restrição separado do cluster TSPY1 original e, portanto, não era contígua. Embora a evidência combinada tenha confirmado uma duplicação complexa da região de 9,3-10,1 Mb, não forneceu nenhuma informação sobre onde as sequências duplicadas foram inseridas. A hibridação in situ da fluorescência metafásica (FISH) com uma sonda TSPY1 mostrou um único sinal (não mostrado), por isso utilizamos a fibra-FISH como descrito anteriormente11 para maior resolução. As sondas cromossômicas em Y foram clones BAC abrangendo a maior parte do ∼9.3-10.1 Mb da seqüência de referência: RP11-334D2 (incluindo TSPY1), RP11-182H20, RP11-155J5, RP11-160K17, e RP11-108I14 (incluindo sequências centrómicas). Os resultados (Figura 2C) mostraram que o cromossoma não afetado foi organizado da mesma forma que a seqüência de referência, que pode ser resumida como TSPY1-182H20-centromere. Em contraste, o cromossoma afetado (Figura 2D) foi interrompido dentro da seqüência 182H20 para produzir a organização TSPY1-parcial 182H20-gap-centromero-duplicação centrômica – duplicação TSPY1-182H20-centromer. Os resultados da fibra-FISH demonstraram assim que as sequências Y duplicadas foram reinseridas localmente de forma rearranjada, mas também revelaram a presença de um segmento que não se hibridizou em nenhuma sonda da região do centômero TSPY1.
Caracterização da Reorganização Estrutural Realizada pelo Cromossomo Y DFNY1
(A) Profundidade relativa de leitura (afetada/afetada) em caixas de 10 kb mapeadas para a seqüência de referência do cromossomo Y entre 9.3 e 10.1 Mb. Note as lacunas de montagem em cada extremidade desta região.
(B) Relação CGH log2 (afetado/afetado) para a mesma região.
(C) Fibra-FISH dos três clones BAC indicados para o cromossomo Y não afetado, mostrando que ele carrega a estrutura de referência nesta região. Tanto o 334D2 como o 108I14 detectam matrizes tandem maiores que o tamanho do clone BAC.
(D) Fibra-FISH dos mesmos clones BAC para o cromossomo Y afetado. Este cromossoma carrega uma inserção que interrompe a região de hibridização 182H20 e contém duplicações parciais das sequências de hibridização 334D2- e 108I14.
(E) Profundidade absoluta de leitura do cromossoma Y não afetado e afetado para os 160.15-160.35 Mb região do cromossomo 1 sequência de referência.
(F) Relação CGH log2 (afetado/afetado) para a mesma região do cromossomo 1.
(G) Metafase FISH do cromossomo 1 BAC clone 179G5 no cromossomo Y não afetado (amarelo). A hibridação é vista apenas no local de referência no cromossoma 1.
(H) Metafase FISH do mesmo cromossoma 1 no cromossoma Y afetado (amarelo). A hibridação é vista em um locus adicional no cromossomo Y.
(I) Fibra-FISH dos dois clones Y BAC indicados mais os clones 574F21, 179G5 e 1365F20 do cromossomo Y não afetado. Nenhum sinal do cromossoma 1 é detectado no cromossoma Y.
(J) Fibra-FISH dos mesmos clones para o cromossoma Y não afetado. Os clones do cromossoma 1 detectam um sinal no Y entre o sinal parcial 182H20 e o sinal 108I14. As coordenadas do genoma referem-se ao GRCh37/hg19.
A fim de identificar estas sequências desconhecidas, realizámos PCR assimétrica térmica entrelaçada (TAIL-PCR)12 no segmento que se estende do ponto de ruptura 182H20 até à fenda usando os iniciadores mostrados na Tabela S2. Em amplificações consecutivas, este procedimento aninhou pares de iniciadores específicos para a sequência conhecida com iniciadores degenerados que se espera que se iniciem na sequência de flanqueamento desconhecida. Os produtos de junção candidatos são reconhecidos porque suas diferenças de tamanho em reações consecutivas refletem as posições conhecidas dos primers. As sequências adjacentes, confirmadas com iniciadores específicos do ponto de ruptura (Tabela S3 e Figuras S2 e S3), foram derivadas do cromossomo 1 (160,16 Mb), e o exame da profundidade de leitura, perfis CGH (Figuras 2E e 2F), e a sequência sugeriu o envolvimento de uma região contígua de ∼160 kb; tal envolvimento foi apoiado pela identificação de uma segunda junção cromossômica mais complexa de 1 Y a 160,32 Mb. A translocação das sequências do cromossoma 1 para o Y afetado foi confirmada pela metáfase FISH (Figuras 2G e 2H), e sua localização dentro da fenda na duplicação em Y foi confirmada pela fibra-FISH (Figuras 2I e 2J) com BACs RP11-574F21, RP11-179G5, e W12-1365F20 do cromossomo 1 como sondas. Os dados combinados revelaram assim uma estrutura complexa de duplicação que consiste tanto de um fragmento do cromossoma 1 como de múltiplos segmentos de DNA Y (Tabela S4 e Figuras S2 e S3). Nenhum dos pontos de quebra sequenciados exibiu extensos comprimentos de homologia, mas todos revelaram microhomologia, um padrão indicativo de FoSTeS (emperramento do garfo e troca de gabarito), que é um mecanismo que combina fragmentos genômicos díspares durante a replicação.13
A estrutura duplicada aqui observada não foi relatada em nenhum outro lugar e deve ter surgido durante um de apenas quatro meiose, que abrange a meiose na qual a própria mutação DFNY1 ocorreu (Figura 1). Portanto, é provável que ela seja causal. As seqüências cromossômicas Y duplicadas codificam apenas uma proteína conhecida, TSPY1, de um conjunto tandem de genes ∼10 TSPY1, enquanto as seqüências cromossômicas 1 carregam cinco genes RefSeq (CASQ1 , PEA15 , DCAF8 , PEX19 , e COPA ) e o final 5′ de outro gene, NCSTN (MIM 605254) (exons 1-3; Figura 3). Os mecanismos pelos quais a duplicação pode levar ao fenótipo da surdez incluem um aumento no número de cópias de genes, expressão inadequada resultante de novo ADN de flanco, ou formação de um produto alterado através de truncagem, fusão, ou mutação pontual. Não há dados de expressão disponíveis na família DFNY1 e não foram encontradas mutações não-sinônimas nos genes do cromossomo 1 RefSeq (Tabela S5). O número de cópias TSPY1 é polimórfico dentro da população,14 e um número maior de cópias TSPY1 foi encontrado sem surdez relatada, incluindo em 47,XYY indivíduos; um estudo associou um número elevado de cópias TSPY1 com um fenótipo diferente, a infertilidade.15 O aumento do número de cópias TSPY1 fornece assim um fraco candidato à surdez. Em contraste, a região do cromossomo 1 encontra-se inteiramente dentro de um intervalo de aproximadamente 900 kb, DFNA49 (MIM %608372), anteriormente associado à perda auditiva; a mutação causal neste intervalo permanece desconhecida.16 Propomos, portanto, que o mesmo gene ou genes possam estar subjacentes aos fenótipos DFNA49 e DFNY1. O mecanismo mais parcimonioso seria a sensibilidade da dosagem de um ou mais destes genes, de tal forma que o aumento da expressão resultante de três cópias leva à perda auditiva, embora outros mecanismos não sejam excluídos.
Estrutura e conteúdo gênico dos cromossomos Y não afetados e afetados
(A) A estrutura do cromossomo Y não afetado (VII-24 na Figura 1). Cinza e preto: erros e lacunas, respectivamente, na montagem do GRCH37. Azul: região que corresponde à sequência de referência ao nível de resolução utilizada. Abaixo são mostrados os dados do conjunto TSPY1 (setas azuis) e a localização dos sinais de clone BAC identificados na Figura 2.
(B) Estrutura do cromossoma Y afetado (VIII-2 na Figura 1). Este cromossoma contém um segmento que não está no cromossoma não afetado; este segmento é derivado de duplicações de seqüências dos cromossomos 1 (amarelo) e Y (azul). Mais uma vez, o conteúdo gênico e os sinais BAC são mostrados abaixo. As setas acima indicam a orientação dos segmentos duplicados em relação à seqüência de referência.
(C) Vista detalhada das duas junções cromossômicas 1-Y estudadas ao nível da seqüência (Figuras S2 e S3), mostrando a diferença entre a estrutura simples da junção 1 e a estrutura complexa da junção 2.
Encontramos a causa da desordem Mendeliana humana ligada ao Y foi associada à inserção de sequências do cromossoma 1 ao invés da mutação de um gene do cromossoma Y. Isto é consistente com as observações de que nem a duplicação (47,XYY cariótipo) nem a deleção (45,X cariótipo) de todo o cromossoma Y e, portanto, de todos os seus genes está associada a deficiência auditiva, implicando que a perda da função ou duplicação de um gene do cromossoma Y é improvável que esteja subjacente ao fenótipo DFNY1. A complexidade do rearranjo é também consistente com a sua raridade: Embora a surdez na linha masculina deva ser um fenótipo facilmente reconhecível, ao nosso conhecimento apenas foi relatada uma única família adicional com um fenótipo semelhante.17 A relação entre as duas famílias é desconhecida; a segunda família também é chinesa, mas de um grupo étnico diferente (Tujia em vez de Han). No entanto, as características audiológicas são semelhantes e, com base no conhecimento atual, é impossível excluir uma origem comum. Apesar da raridade deste rearranjo específico, vemos no entanto a aquisição de sequências autossómicas pelo cromossoma Y como uma parte padrão da evolução do cromossoma Y, normalmente neutra e ocasionalmente atingindo fixação, embora no caso do DFNY1 seja desvantajosa. De facto, é de salientar que o cromossoma Y transporta uma inserção fixa de ∼100 kb da região cromossómica 1q43 em Yq proximal,18 perto da inserção DFNY1. Esta observação levanta a questão de se a proximidade no núcleo pode favorecer a transferência de DNA entre estes dois cromossomos.19 O mecanismo mutacional proposto pela DFNY1, FoSTeS, foi anteriormente associado apenas a rearranjos intracromossômicos,13 pelo que o presente estudo expande sua influência para incluir rearranjos intercromossômicos; também destaca a necessidade de uma melhor compreensão da relação negligenciada entre variação do número de cópias e deficiência auditiva.20