Localizada na Califórnia Central, a Missão San Luis Obispo de Tolosa tem o nome de São Luís, Bispo de Toulouse, e foi fundada em quinto lugar na cadeia em 1º de setembro de 1772 pelo Padre Junipero Serra. A missão foi fundada três anos depois que os pais descobriram pela primeira vez La Cañada de Los Osos – o Vale dos Ursos – durante uma viagem fracassada de San Diego em busca de Monterey.
Como os suprimentos diminuíram em 1772 nas já estabelecidas quatro missões da Califórnia, os residentes foram atormentados pela escassez de alimentos. Lembrando o Vale dos Ursos, uma expedição de caça foi enviada no verão de 1772 para trazer carne de volta. Os índios locais agradeceram aos soldados por matar os ursos, um inimigo temido. Parte da carne foi trocada com a população local em troca de sementes comestíveis, após o que o padre Serra decidiu que La Cañada de Los Osos seria o lugar ideal para a quinta missão. Embora a cidade de San Luis Obispo não tenha permanecido um país acidentado de ursos, uma estátua de um urso pardo senta-se como lembrança na praça da missão.
Em 1776, quatro anos após sua fundação, um índio disparou uma flecha flamejante sobre o teto de um dos edifícios da missão, iniciando um incêndio desastroso que danificou severamente vários edifícios. Após este incidente, os pais começaram a trabalhar na fabricação de telhas localmente, para reduzir a suscetibilidade ao fogo.
Como a cidade se modernizou, a missão também o fez. O que antes era a sopa dos pais é agora este centro juvenil. A Missão San Luis Obispo é uma das únicas missões que nunca teve que se mudar; ela ainda está em seu local original.
As paredes da missão, que têm de 50 a 60 pés de altura, foram construídas de acordo com a lei do Vaticano. Esta lei afirmava que as igrejas seriam construídas tão altas como a árvore local – neste caso, o pinheiro. A igreja, com uma longa nave secundária forma uma igreja em forma de L, a única de seu tipo entre as missões da Califórnia.
Pai Luis Antonio Martinez, que dirigiu a missão por 34 anos, cultivou um grande vinhedo missionário. Ele vendeu parte deste vinho para as outras missões quando não puderam cultivar o seu próprio vinho, e também o exportou para a Inglaterra e Rússia.