- Animais experimentais
- Análises histológicas
- Hibridização in situ de fluorescência mono-molécula (smFISH)
- Ensaio de incorporação de EdU para proliferação de LECs
- Electron microscopy
- Imagens intravitais de depuração lipídica da lâmina propria
- Teste de absorção lipídica
- Transpiração de AAV
- Tratamento do anticorpo
- Enriquecimento do LEC intestino delgado e isolamento do IntSC
- Cultura primária de ratos IntSCs
- Citometria de fluxo e classificação celular
- Bulk RNA-sequenciamento
- MEFs e HDLECs
- Ensaio de brotação à base de esferoides
- Quantitative RT-PCR
- Estiramento in vitro e experimentos osmóticos
- Experimentos osmóticos ex vivo
- Immunofluorescência de MEFs
- ChIP-qPCR
- ELISA
- Análise morfométrica
- Sequenciamento de RNA monocelular baseado em gotículas
- Pré-processamento de dados de RNA de células únicas
- Identificação de genes de variáveis e redução de dimensionalidade
- Análise de Cluster
- Análise de enriquecimento ontológico do gene
- Estatistica
- Reporting summary
Animais experimentais
Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram cumpridos todos os regulamentos éticos para pesquisa e testes com animais sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (No. KA2016-12) da Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Os ratos Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 e Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 foram transferidos, estabelecidos e criados em instalações animais livres de patógenos específicos (SPF) no KAIST. Os ratos C57BL/6 J, R26-tdTomato e Myh11-Cre-ERT2 foram comprados no Laboratório Jackson. Todos os ratos foram mantidos no fundo C57BL/6 e alimentados com acesso livre a uma dieta padrão (PMI LabDiet) e água. A fim de induzir atividade Cre-ERT2 nos ratos Cre-ERT2, 2 mg de tamoxifeno (Sigma-Aldrich) dissolvido em óleo de milho (Sigma-Aldrich) foi injetado intraperitonealmente (i.p.) nos pontos de tempo indicados para cada experimento. Cre-ERT2 negativo mas flox/flox-positivo entre os ratos de leite foram definidos como ratos de controle (WT) para cada experimento. Ratos foram anestesiados com injeção i.p. de uma combinação de anestésicos (80 mg/kg de ketamina e 12 mg/kg de xilazina) antes de serem sacrificados.
Análises histológicas
Para coloração de intestino delgado, a perfusão transcardial foi realizada com paraformaldeído (PFA) a 2% após a anestesia. O intestino delgado foi colhido e cortado longitudinalmente para expor o lúmen. Após várias lavagens com PBS, os intestinos foram fixados em placas de silicone. As amostras foram então pós-fixadas a 4 °C em PFA a 4% durante 2 h. As amostras foram lavadas com PBS várias vezes e posteriormente desidratadas com sacarose a 10% em PBS durante 2 h e com sacarose a 20%, glicerol a 10% em PBS durante a noite. A pele do ouvido, traquéia e diafragma foram colhidos sem perfusão transcárdica e fixados em PFA a 4% durante 1 h a 4 °C. As amostras foram lavadas com PBS várias vezes antes de serem bloqueadas. Após o bloqueio com 5% de soro de cabra ou burro em 0,5% de Triton-X 100 em PBS (PBST) durante 1 h, as amostras foram incubadas com os anticorpos primários indicados diluídos na solução de bloqueio a 4 °C durante a noite. Após várias lavagens com PBST, as amostras foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente (RT) com os anticorpos secundários conjugados com fluorocromo indicados, diluídos no tampão de bloqueio. As amostras foram lavadas com PBST e os núcleos foram corados com DAPI (Invitrogen). Após a lavagem com PBS, as amostras foram montadas com Vecta-shield (Vector Laboratories). As imagens foram obtidas utilizando o microscópio confocal Zeiss LSM 800 ou LSM 880 (Carl Zeiss).
Os seguintes anticorpos primários e secundários foram utilizados na imunoglobulina: anti-LYVE-1 (policlonal de coelho, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (monoclonal de rato, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (monoclonal de hamster, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-cadherin (policlonal de cabra, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (policlonal de cabra, AF2727, R&D, 1:400); anti-Prox1 (policlonal de coelho, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anti-VE-cadherin (policlonal de cabra, AF1002, R&D, 1:200); anti-PDGFRβ (monoclonal de cabra, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (monoclonal de rato, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (policlonal de cabra, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (monoclonal de coelho, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (policlonal coelho, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (policlonal coelho, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (policlonal coelho, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (policlonal de cabra, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (policlonal de coelho, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (policlonal de cabra, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (monoclonal de coelho, 14074, Sinalização celular, 1:200); anti-TAZ (policlonal de coelho, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-αSMA, Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) – conjugado (monoclonal de rato, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (policlonal de cabra, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (policlonal de cabra, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (monoclonal de coelho, 13179, Sinalização celular, 1:400); anti-F4/80, conjugado com FITC (monoclonal de rato, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (monoclonal de hamster, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmin (policlonal de coelho, AB907, Millipore, 1:400); e Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-conjugated anti-coelho, anti-rato, anti-cabra, anti-hamster secondary antibodies (diluído a uma proporção de 1:1000) foram comprados à Jackson ImmunoResearch. Todos os anticorpos utilizados no nosso estudo foram validados para as espécies e aplicações.
Hibridização in situ de fluorescência mono-molécula (smFISH)
Para smFISH de intestino delgado, a perfusão transcardial foi realizada com PFA a 2% após anestesia. As amostras foram fixadas a 4 °C em AFP a 4% durante 2 h. As amostras foram lavadas com PBS várias vezes, movidas a 30% de sacarose e incubadas durante a noite. As amostras embutidas na TOC foram seccionadas, e realizamos o smFISH de acordo com o protocolo do fabricante, descrito no kit do ensaio RNAscope Fluorescent Multiplex Assay (320850, ACDBio). Para o smFISH foi utilizada a Sonda RNA (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2). Os seguintes anticorpos primários e secundários foram usados na imuno-contaminação com smFISH: anti-PDGFRβ (monoclonal de rato, ab91066, Abcam); anti-Shisa3 (policlonal de coelho, TA320118, Origene); anti-P2X1 (policlonal de coelho, APR-001, Alomone labs) e Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647 – anticorpos secundários conjugados foram comprados à Jackson ImmunoResearch. As imagens foram obtidas usando o microscópio confocal Zeiss LSM 800 ou LSM 880 (Carl Zeiss).
Ensaio de incorporação de EdU para proliferação de LECs
Para detectar a proliferação de LECs em lactato, 5 mg de 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU, A10044, Invitrogen) foram dissolvidos em 1 ml de água Milli-Q como solução de reserva. Então, 200 μl da solução de reserva por rato foi injectada i.p. de dois em dois dias durante uma semana antes da análise. O intestino delgado foi isolado e processado como descrito acima. Células incorporadas ao EdU foram detectadas com o Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.
Electron microscopy
Para capturar imagens microscópicas eletrônicas de ultraestrutura do intestino delgado, o intestino delgado foi seccionado após perfusão transcárdica com PFA 4% e glutaraldeído 0,25% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4). As amostras foram então fixadas de um dia para o outro em glutaraldeído a 2,5%, pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1%, e desidratadas com uma série de concentrações crescentes de etanol, seguidas de incorporação de resina. Foram obtidos cortes ultramicrotomos (UltraCut-UCT, Leica), que foram então coletados em redes de cobre. As amostras foram imitadas com transmissão EM (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) a 120 kV após coloração com acetato de uranila a 2% e citrato de chumbo.
Imagens intravitais de depuração lipídica da lâmina propria
Ratos foram anestesiados após a remoção dos alimentos durante 12 h antes do procedimento. A imagem intravascular foi realizada como descrito anteriormente34. Em resumo, as sondas lipídicas BODIPY (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) foram dissolvidas em solução de DMSO a 2,5% (Sigma-Aldrich). Anti-LYVE-1 (monoclonal de rato, 223322, R&D) conjugado com o anticorpo Alexa Fluor 647 (Invitrogen) (0,75 mg/kg) foi injetado por via intravenosa às 12 h antes da imagem para rotulagem fluorescente de lactatos. Em seguida, o jejuno proximal foi exteriorizado em uma câmara de imagem onde a temperatura foi mantida a 37 °C durante a imagem. Após abertura cirúrgica da luz intestinal de 1,5 cm ao longo da borda antimesentérica, um vidro de cobertura foi colocado sobre a luz exposta para obter uma visão vil. A imagem intravital foi feita ao longo de três sessões. As vilosidades foram primeiramente imersas antes do fornecimento de BODIPY-FA a 0 min. Em seguida, 30 μl de sondas lipídicas BODIPY foram fornecidas uma vez antes da segunda sessão de imagem para observar a absorção lipídica inicial de BODIPY a 1 minuto. Em seguida, os lípidos BODIPY-FA foram fornecidos três vezes com intervalos de 2 min antes da terceira sessão de imagens aos 26 min, e a compensação de BODIPY-FA através de lacteals foi analisada aos 36 min e 46 min. Foi utilizado um microscópio confocal de varredura a laser de vídeo caseiro34. Dois lasers de onda contínua emitindo a 488 nm (MLD, Coherent) e 640 nm (Cube, Coherent) foram utilizados como fontes de excitação para imagens fluorescentes. Dois filtros passa-banda (FF01-525/50 e FF01-685/40, Semrock) foram utilizados para a detecção de sinais fluorescentes. A resolução axial abaixo de 4 μm foi adquirida com 100 μm pinhole e 60x lente objetiva (LUMFLN, imersão em água, NA 1.1, Olympus). As imagens (512 × 512 pixels) foram obtidas a uma taxa de quadros de 30 Hz. Para o aprimoramento da relação sinal-ruído da imagem, o ruído acima de 90 quadros após o pós-processamento das imagens em tempo real (30 quadros/segundo) foi obtido através da remoção do artefato de movimento gerado do peristaltismo com um programa MATLAB personalizado. O software ImageJ (NIH) foi usado para medir a intensidade fluorescente média na lâmina própria.
Teste de absorção lipídica
Retirada de alimentos por 12 h, 200 μl de azeite de oliva (Sigma-Aldrich) foi entregue por gavagem oral para medição de triglicérides de plasma e coloração Oil Red O. O sangue foi amostrado através da veia caudal para o tubo de recolha de sangue contendo heparina a 0, 1, 2, 3, e 4 h após a administração de azeite de oliva. A concentração de triglicéridos plasmáticos foi medida usando um analisador de química VetTest (Laboratório IDEXX). O intestino delgado foi corado com Oil red O às 12 h após a gavagem do azeite, seguindo o protocolo do fabricante do Kit de Coloração de Óleo Red O (MAK194, Sigma-Aldrich). A alimentação com dieta rica em gordura (HFD) (60% kcal de gordura, Dietas de Pesquisa, D12492) começou com 12 semanas de idade e continuou durante 8 semanas para a medição dos triglicéridos de plasma e coloração de Oil Red O. O sangue foi recolhido através da veia caudal para o tubo de recolha de sangue contendo heparina após 6 h de jejum. Para a coloração de Oil red O de cortes de fígado, o fígado colhido, fixado em 4% PFA durante a noite a 4 °C, foi cortado a 100 μm cortes de vibração (Leica, VT1200S), foram corados com Oil red O.
Transpiração de AAV
Ratos indicados receberam um único i.p. (1012 partículas virais em 150-200 µl) de um AAV recombinante que codifica os domínios ligantes 1-4 do VEGFR3 fundidos ao domínio IgG Fc (AAV-mVEGFR31-4-Ig), e ratos de controle receberam a mesma dose de AAV que codifica os domínios 4-7 do VEGFR3, que não ligam VEGF-C ou VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), fundidos ao domínio IgG Fc, como descrito anteriormente37. AAV-mVEGFR31-4-Ig e AAV-mVEGFR34-7-Ig foram detectados no soro por análise de immunoblotting (anticorpo anti-VEGFR3; policlonal de cabra, AF743, R&D) de 0.5 μl de amostras de soro colhidas no mesmo dia da análise intestinal.
Tratamento do anticorpo
Para o bloqueio do VEGFR2, foi utilizado um anticorpo neutralizante VEGFR2 (DC101). Uma linha de células híbridas que produz DC101 foi adquirida da American Type Culture Collection (ATCC). As células de hibridoma foram cultivadas em meio livre de soro. As proteínas recombinantes nos sobrenadantes foram purificadas por cromatografia em coluna com gel de agarose Proteína A (Oncogene). Após a purificação, as proteínas recombinantes foram quantificadas usando o ensaio de Bradford e confirmadas pela coloração azul de Coomassie após eletroforese em gel de dodecyl sulfato de sódio (SDS) -poliacrilamida (PAGE). DC101 (50 mg/kg) ou uma quantidade igual do anticorpo controle (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) foi injetado i.p. nos ratos indicados a cada 2 dias durante 2 semanas.
Enriquecimento do LEC intestino delgado e isolamento do IntSC
Os tecidos serosos, musculares e adiposos mesentéricos foram removidos do intestino delgado. Após a abertura longitudinal dos fragmentos intestinais e lavagem com PBS, as amostras foram cortadas em pedaços de 2 cm, e as manchas de Peyer foram removidas. As amostras foram lavadas com PBS e incubadas com EDTA 10 mM com DMEM (Gibco) livre de cálcio e magnésio sobre gelo durante 20 min. Os tecidos foram vortexados com PBS livre de cálcio até a obtenção de um sobrenadante claro que fosse desprovido de células epiteliais. As amostras foram cortadas em fragmentos de 1 mm e dissociadas com tampão de dissociação contendo 2 mg/ml de colagenase II (Worthington), 1 mg/ml de dispase (Gibco) e 1 U/ml de DNase (Invitrogen) em DMEM a 37 °C por 30 min. Para ajudar na dissociação, os pedaços de tecido foram suavemente pipetados para cima e para baixo a cada 10 minutos. As amostras foram então filtradas através de um filtro 70 μm para desagregar mecanicamente os fragmentos intestinais restantes. Após a coleta dos sobrenadantes, foi adicionado um volume igual de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Após a centrifugação, as células foram ressuspendidas em PBS. Para enriquecer a fração celular do estroma e LECs, células hematopoiéticas e células epiteliais foram esgotadas usando AutoMACS (Miltenyi) após incubação por 15 min em gelo com anti-CD45 e anti-CD326 Microbeads (Miltenyi). Para o isolamento IntSC, foram adicionadas micro esferas anti-CD31 (Miltenyi) para esgotar as células endoteliais, além das micro esferas anti-CD45 e anti-CD326.
Cultura primária de ratos IntSCs
Segundo o isolamento de IntSCs, as células foram cultivadas com DMEM/F12 contendo 10% de FBS em uma placa de cultura de tecidos por 24 h ou 2 dias. Para tratamentos medicamentosos e coloração por imunofluorescência, 50.000 células por poço foram plaqueadas em lâminas de 4 poços de Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich). As concentrações dos medicamentos são descritas nas legendas das figuras indicadas e os tratamentos duraram 6 h para análise de imunofluorescência e expressão gênica. Uma placa de imagem de 35 mm com superfície Elasticamente Suportada (Ibidi) foi utilizada para cultura IntSC em matrizes moles (1,5 kPa) e rígidas (28 kPa) durante 24 h. Para indução de atividade cremosa em IntSCs cultivados primários derivados de ratos WT ou Yap/Tazi∆FRC, as células foram tratadas com 5 µM de 4-hidroxi-amoxifeno (4-OHT) em etanol 100% (EtOH) ou 100% EtOH sozinho durante 2 dias como controle. Para os experimentos foram utilizadas monocamadas de cultura expandida de IntSCs validadas como PDGFRβ+.
Citometria de fluxo e classificação celular
Para classificar PDGFRβ+ IntSCs ou LECs intestinais, as frações enriquecidas foram para lise de hemácias por suspensão em tampão de lise ACK (Gibco) por 5 min em RT. Após bloquear os receptores Fcγ com anti-CD16/CD32 (553141, BD Bioscience), as células foram incubadas por 15 min com anticorpos indicados em tampão FACS (2% FBS em PBS). Após várias lavagens, as células foram analisadas pelo FACS Canto II (BD Biosciences) e os dados adquiridos foram avaliados posteriormente usando o software FlowJo (Treestar). A classificação celular foi realizada com FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). As células mortas foram excluídas usando a coloração DAPI (Sigma-Aldrich) e os doublets celulares foram sistematicamente excluídos. A intensidade da fluorescência é expressa em unidades arbitrárias numa escala logarítmica, e a dispersão para a frente e a dispersão lateral são representadas numa escala linear. Os seguintes anticorpos foram usados para a citometria de fluxo: FITC anti-mouse CD45 (11-0451-85, monoclonal de rato, Biolegend); FITC anti-mouse TER-119 (11-5921-85, monoclonal de rato, Biolegend); APC anti-mouse CD31 (551262, monoclonal de rato, BD Bioscience); e PE/Cy7 anti-mouse Podoplanin (127412, monoclonal de hamster sírio, Biolegend).
Bulk RNA-sequenciamento
Bulk RNA-sequenciamento do isolado PDGFRβ+ IntSCs foi realizado através da obtenção do arquivo de alinhamento. Resumidamente, as leituras foram mapeadas usando a ferramenta do software TopHat. O arquivo de alinhamento foi usado para montar transcrições, estimar suas abundâncias e detectar a expressão diferencial de genes ou isoformas usando botões de punho. A ferramenta de Análise de Caminhos da Ingenuidade (QIAGEN) foi usada para avaliar melhor os dados no contexto da sinalização canônica e determinar se os genes YAP/TAZ-hiperativados estavam especificamente relacionados com as moléculas secretoras. O significado da sinalização canônica foi testado pelo procedimento Benjamini-Hochberg, que ajusta o valor de P para corrigir para múltiplas comparações, e sua ativação ou inibição foi determinada com referência a z-scores de ativação. Análise de cluster e heatmaps foram gerados usando Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Para GSEA, foram usadas coleções de conjuntos de genes do Banco de Assinaturas Moleculares 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/).
MEFs e HDLECs
Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) foram isolados de embriões E12.5 como descrito anteriormente32. Resumidamente, os tecidos da cabeça, membros e coração foram removidos e as amostras foram picadas com tesoura e digeridas com trypsin/EDTA 0,1% com DNase (1 U/ml, Invitrogen) a 37 °C durante 20 min. Após a digestão e remoção dos tecidos não digeridos, as células foram rodadas brevemente, colocadas num prato de 10 cm, e deixadas crescer até à subfluência. Os MEFs foram então mantidos em DMEM/F12 contendo 10% de FBS. Células linfáticas endoteliais dérmicas humanas (HDLECs) foram compradas de Lonza e cultivadas em meio de crescimento endotelial (EGM2-MV, Lonza). Os MEFs e HDLECs foram usados na passagem 2 ou 3. As células foram incubadas em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37°C e confirmadas como sendo micoplasma-negativas (MycoAlert Detection Kit, Lonza).
Ensaio de brotação à base de esferoides
Esferoides HDLEC foram gerados através do cultivo de HDLECs na passagem 2 ou 3 em meio de cultura contendo 0,25% de metilcelulose e incubando durante a noite como gotas suspensas36. Os esferoides foram então coletados e incorporados em 2 mg/ml de colágeno tipo I (Corning), tratados com albumina de soro bovino controle (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) ou ANGPT2 (5 μg/ml, gerado internamente) com ou sem VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) em Meio Basal de Células Endotelial (PromoCell) contendo 1% FBS durante 24 h. No final da incubação, o esferóide foi corado com o rastreador de células (Sondas Moleculares, 1,5 μM, 37 °C, 30 min). Os esferoides foram então fixados em PFA 4% durante 15 min em RT e imerso em Cell observer (Carl Zeiss).
Quantitative RT-PCR
RNA foi extraído usando RNeasy Micro kit (Qiagen) ou Trizol RNA extraction kit (Invitrogen). Um total de 1 µg de RNA extraído foi transcrito em cDNA usando o GoScript Reverse Transcription Kit (Promega). A PCR quantitativa em tempo real foi realizada usando FastStart SYBR Green Master mix (Roche) e S1000 Thermocycler (Bio-Rad) com os primers indicados. Os primers foram desenhados usando Primer-BLAST ou adotados a partir de estudos publicados anteriormente, os quais estão descritos na Tabela Complementar 1. Gapdh foi utilizado como gene de referência e os resultados foram apresentados como expressões relativas ao controle. A especificidade da reação do primer foi confirmada pela análise da curva de fusão. A expressão gênica relativa foi analisada pelo método ΔΔCt utilizando o software CFX Manager (Bio-Rad).
Estiramento in vitro e experimentos osmóticos
MEFs e IntSCs de mouse primário foram estirados utilizando um instrumento mecânico de estiramento celular (STREX) com 4% de estiramento linear a 10 ciclos/min, e a tensão osmótica foi aplicada com sorbitol 0,4 M durante 3 h, conforme descrito anteriormente40,50. As células foram mantidas em uma incubadora úmida de 5% de CO2 a 37°C durante todos os experimentos.
Experimentos osmóticos ex vivo
Após a abertura da cavidade abdominal sob anestesia, parte do intestino delgado foi cortada em pedaços de 2 cm. Os fragmentos intestinais foram abertos longitudinalmente e lavados com PBS. Os tecidos foram então cultivados em DMEM/F12 incluindo 5% de FBS e o estresse osmótico foi aplicado imediatamente com sorbitol 0,4 M no meio de cultura por 3 h. Os tecidos foram mantidos em uma incubadora úmida de 5% de CO2 a 37 °C durante todos os experimentos.
Immunofluorescência de MEFs
MEFs foram cromadas em lâminas de 8 poços de Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich) e fixadas com paraformaldeído a 4% por 15 min a 4 °C. Após várias lavagens com PBS, as amostras foram bloqueadas com soro de cabra (ou burro) a 5% em 0,5% PBST durante 30 min a RT. As células foram incubadas com os anticorpos primários indicados a 4 °C durante a noite. Os anticorpos primários ligados foram detectados incubando com os anticorpos secundários durante 90 min na RT. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários para a coloração celular: anti-YAP (monoclonal de coelho, 14074, Sinalização celular); anti-TAZ (policlonal de coelho, HPA007415, Sigma-Aldrich); e anticorpos Alexa Fluor 488 conjugado anti-phalloidin (A12379, Thermo Fisher). Os anticorpos secundários conjugados Alexa Fluor 594 foram adquiridos à Jackson ImmunoResearch. Os núcleos foram corados com DAPI (Invitrogen) e as lâminas foram montadas e imitadas como descrito acima.
ChIP-qPCR
MEFs foram fixadas com PFA a 1% durante 10 min e extinguidas com glicina. As amostras foram lavadas com PBS e lisadas com tampão de lise contendo 1% de SDS. O DNA fixo nos lisados celulares foi sonicado com o uso do Focused-ultrasonicator (Covaris). Os lisados celulares foram centrifugados, e todos os sobrenadantes resultantes foram diluídos com tampão de diluição ChIP contendo 0,5% de Triton X-100, exceto 5% (salvo para controle de entrada do lisado celular inteiro). As amostras diluídas foram então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-TEAD4 (monoclonal de rato, ab58310, Abcam). Em seguida, foram adicionadas as proteínas A/G Dynabeads (Thermo Fisher) e as amostras foram incubadas durante 2 h a 4 °C. As esferas foram isoladas com DynaMag-2 (Thermo Fisher), lavadas com séries de tampão de lavagem ChIP: tampão de lavagem baixo-sal, tampão de lavagem alto-sal, tampão de lavagem LiCl, e tampão TE. As amostras foram eluídas em 1% SDS duas vezes durante 15 min cada a 65 °C. Os grânulos foram removidos e tanto o material eluído quanto as amostras de entrada de lisado de 5% de células inteiras foram reticuladas durante a noite a 65 °C. Após normalização do pH, as amostras foram incubadas durante 30 min com RNase (3 μg/mL) a 37 °C e durante 2 h com proteinase K (20 mg/ml) e glicogénio (20 mg/ml) a 55 °C. O DNA foi eluido usando procedimentos padrão e o ChIP-DNA foi analisado pelo qPCR comparado com as amostras de entrada usando os primers listados na Tabela Suplementar 2.
ELISA
Supernadante de cultivo primário de camundongos IntSCs foram colhidos após o alongamento, e o sobrenadante foi centrifugado por 15 min. A concentração de VEGF-C em sobrenadante foi medida pelo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) com o kit ELISA específico para VEGF-C de mouse (CSB-E07361m, Cusabio).
Análise morfométrica
Medições morfométricas foram realizadas utilizando os softwares ImageJ (NIH), ZEN 2012 (Carl Zeiss), ou Imaris (Bitplane). Para quantificação da área de superfície lacteal, foi estabelecido um limiar para as imagens a serem analisadas e foi medida a área de vilosidade absoluta LYVE-1+ para cada vilosidade lacteal dentro da vilosidade. Comprimento absoluto das vilosidades lácticas, comprimento absoluto das vilosidades e largura absoluta das vilosidades foram medidos usando imagens de vilosidades E-cadherin+ ou CD31+ ou LYVE-1+ em cada campo aleatório de 850 µm2 da parte indicada do intestino. Para quantificações da superfície, comprimento e largura das vilosidades, foram analisadas pelo menos 100 vilosidades ao longo de todo o intestino delgado. Quantificações para os seguintes parâmetros no intestino delgado foram realizadas em jejuno. O número de brotos lacteais e o número de ramificações lacteais foram medidos em 10-20 LYVE-1+ lacteal aleatórios. Número de LECs Prox1+ e número de LECs Prox1+EdU+ foram contados manualmente dentro de 100 μm comprimento de 10-20 LYVE-1+ lacteal aleatório. A quantificação das junções VE-cadherin+ de Lactteal foi realizada com lente objetiva ×40 em LYVE-1+ de 5-10 vilosidades por rato. Em resumo, a junção tipo zipper foi definida como junção contínua nas bordas celulares com células de forma alongada51. A junção tipo botão foi definida como junções descontínuas que não são paralelas com as bordas celulares e com a forma celular de folha de carvalho. As junções que não correspondem a nenhum dos dois padrões foram categorizadas como de tipo misto. A intensidade de fluorescência (FI) do BODIPY e sua quantificação foi realizada conforme descrito anteriormente34. A área Oil red O foi medida como área Oil red O+ dividida pela área das vilosidades e normalizada pela média dos ratos de controle. A área de cobertura das células musculares lisas das vilosidades foi medida como área de cobertura absoluta αSMA+ em cinco campos de 850 µm2 por amostra, que foi então normalizada pela média dos campos dos ratos-controle. Para quantificar as expressões relativas do VEGFR3 lacteal, a FI média foi medida em cinco campos de 425 µm2 por amostra e foi apresentada como valores relativos divididos pelo seu controle. Para determinar a densidade dos vasos sanguíneos, a área do VEGFR2 foi medida em cinco campos de 425 µm2 por amostra e foi apresentada como valores relativos ao seu controle. A área da célula T CD3+ ou macrófago F4/80+ foi medida em cinco campos de 425 µm2 por amostra. A densidade de vasos linfáticos foi calculada medindo a área de LYVE-1+ em cinco campos aleatórios de 425-850 µm2 de amostras de montagem inteira e apresentada como valores relativos ao seu controle.
Sequenciamento de RNA monocelular baseado em gotículas
Células únicas foram processadas usando o conjunto de células únicas de cromo 10X 3′ Reagente Kit v3 (10X genômica) seguindo os protocolos do fabricante. Resumidamente, as células classificadas foram ressuspendidas em PBS com 0,5% de BSA e misturadas com mistura de reagentes RT e primer RT, que foram então adicionados a cada canal em chips 10X, visando 5000 células. As células foram separadas em Gel Beads em Emulsão onde transcrições de RNA de células únicas foram codificadas por código de barras e transcritas inversamente. Após a construção e amplificação da biblioteca de cDNA, as moléculas de cDNA foram enzimaticamente fragmentadas, reparadas no final e com cauda em A. Após selecionar o tamanho apropriado das moléculas de cDNA processadas através da seleção de tamanho duplo usando contas SPRI (Beckman Coulter), elas foram ligadas com um adaptador, e foi realizada a PCR de índice de amostra. Após outra seleção de tamanho duplo usando esferas de SPRI, as construções finais da biblioteca foram diluídas 10 vezes e executadas no chip do Bioanalisador Agilent High Sensitivity Chip para controle de qualidade. As bibliotecas de células únicas foram então sequenciadas usando a plataforma Illumina HiSeq-X.
Pré-processamento de dados de RNA de células únicas
Dados de sequenciação bruta foram primeiro desmultiplexados e mapeados para o genoma de referência do rato (mm10) usando o kit de ferramentas Cell Ranger 3.0.2 da 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Usando o pacote R Seurat (versão 3.0.0)52, matrizes de expressão bruta foram construídas usando a função Read10X. Foram excluídas as células com menos de 1000 genes detectados ou com mais de 6000 genes detectados (considerados como potenciais doublets) (Suplemento Fig. 17a). Além disso, células com alto gene mitocondrial associado ao identificador molecular único (IMC) (>7% do total) foram consideradas como células mortas e, portanto, excluídas. Para os genes, aqueles expressos por menos de 3 células foram removidos. Além disso, um pequeno número de células imunes Ptprc+ contaminantes e células endoteliais Pecam1+ Cdh5+ foram excluídas após a ronda inicial de agregação. Após a remoção de células e genes indesejáveis, as contagens do IMC para cada gene de uma célula foram divididas pela expressão total de uma determinada célula e multiplicadas por 10.000 e log-transformadas. Em seguida, os genes foram escalados e centralizados através da regressão de variáveis como percentagem de genes mitocondriais e número de IMCs.
Identificação de genes de variáveis e redução de dimensionalidade
R pacote Seurat foi usado para análise de agrupamento. Primeiro, genes altamente variáveis através do conjunto de dados foram identificados usando a função FindVariableFeatures no Seurat com opção: selection.method = “vst”. Os 2000 genes com maior variabilidade foram selecionados para análise downstream. Usando os genes variáveis identificados, as reduções de dimensionalidade inicial foram realizadas usando a análise de componentes principais (PCA). A função JackStraw foi utilizada para determinar a significância estatística das pontuações da PCA. Os 30 componentes principais (PCs) mais significativos foram utilizados como entrada para a Aproximação e Projeção Uniforme de Coletores (UMAP) para reduzir os dados em espaço bidimensional.
Análise de Cluster
A fim de agrupar as células por seus perfis transcripcionais, realizamos um agrupamento não supervisionado nos 2000 principais genes altamente variáveis para todas as quatro amostras. Primeiro construímos o gráfico de vizinhança mais próxima (SNN) no espaço do componente principal, usando a função FindNeighbors. Em seguida, aplicamos algoritmo de louvaina para agrupamento baseado em otimização modular, usando a função FindClusters. Os parâmetros de resolução de clustering foram definidos no ponto em que os clusters mostraram perfis transcripcionais altamente distintos. Os aglomerados foram independentes do número de genes detectados por célula (Suplemento Fig. 17b). Os marcadores específicos dos clusters foram expressos diferentemente para cada gene identificado através da função FindMarkers no Seurat com as seguintes configurações: min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15,test.use = “MAST”. Marcadores identificados com P < 0.05 ajustados foram usados para análise posterior. Como alguns tipos de células como células musculares lisas e células murais tinham marcadores bem conhecidos, sua aparência no topo da lista de marcadores para cada cluster validou nossos processos de seleção de marcadores. Para remover fontes indesejadas de variações como sexo, as células foram divididas por Xist de transcrição específica feminina e integradas. Para realizar a integração de diferentes conjuntos de dados, primeiro normalizamos cada matriz de expressão bruta e identificamos os 2000 genes altamente variáveis para cada conjunto de dados. Em seguida, usando a função FindIntegrationAnchors em Seurat, identificamos âncoras entre os conjuntos de dados. Em seguida, os conjuntos de dados foram integrados com base nas âncoras identificadas através da função IntegrateData no Seurat. Os conjuntos de dados integrados foram então escalados e as dimensões foram reduzidas para análises de cluster adicionais. Clusters nos conjuntos de dados integrados foram anotados por seus perfis de expressão de genes nas listas de marcadores identificados.
Análise de enriquecimento ontológico do gene
Análise de enriquecimento ontológico do gene nos marcadores de cluster foram realizados usando o pacote R goseq (versão 1.34.0)53. Dependendo do comprimento do gene, foram obtidas ponderações para cada gene e a aproximação de Wallenius foi usada para identificar termos ontológicos associados ao gene. Os termos da ontologia gênica que ajustaram P < 0,05 e as categorias de processo biológico foram selecionadas.
Estatistica
Não foram utilizados métodos estatísticos para predeterminar o tamanho da amostra. Os experimentos foram randomizados e os investigadores foram cegos para alocação durante os experimentos e análises de resultados. Todos os valores são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A significância estatística foi determinada pelo teste Mann-Whitney U bilateral entre dois grupos ou pela ANOVA bilateral com o teste de comparações múltiplas de Holm-Sidak para comparação de múltiplos grupos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.
Reporting summary
Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.