U.S. Food and Drug Administration

p>SUBJEITO ITG: PYROGENS, STILL A DANGER

Introdução

O advento da agulha hipodérmica proporcionou uma nova via para a administração de drogas. \Mas, pela referência de hoje, os fármacos parentéricos precoces eram grosseiros e inseguros, na medida em que o aumento do uso dessas soluções de injeção precoces trouxe suas infecções, reações adversas aos fármacos, febres de etiologia desconhecida, e até mortes por choque. Foi desconcertante para os trabalhadores iniciais no campo da microbiologia que febres esporádicas resultaram da injeção de até mesmo soluções estéreis.

Soluções de injeção modernas são mais seguras, mas a literatura continua a relatar reações adversas. Nesta edição compartilhamos as preocupações do paciente que não pode tomar líquidos pela boca, devido à cirurgia ou a certos tipos de doença, que pode sofrer as conseqüências de toxinas indesejáveis conhecidas como substâncias produtoras de febre, se presentes no produto parenteral. Esperamos mostrar os benefícios do que foi aprendido nesta área.

Histórico – Pirogênios

Sabia-se na segunda metade do século XIX que algumas soluções parenterais causavam um aumento acentuado da temperatura corporal. Os agentes produtores de febre não eram conhecidos. Os males desta “substância febril” eram descritos de forma variada como “febre por injeção”, “febre da água destilada”, e “febre salina”, entre outros termos. Hoje, os pirogénios bacterianos são reconhecidos como o agente causador responsável por muitas dessas febres precoces e por muitos outros efeitos biológicos descritos como acidentais à terapia parenteral. A partir disso, podemos entender por que se deve ter o maior cuidado durante a preparação e uso de soluções injetáveis para excluir o pirogênio oculto.

Defesa Natural e Pirogênios

Como seres humanos saudáveis submetidos a uma distribuição universal de micróbios no ambiente, coexistimos com o mundo microbiano. Normalmente as defesas naturais do organismo restringem os micróbios e seus metabolitos (toxinas, etc.) a áreas onde eles podem ser tolerados, como na pele e no trato alimentar. A via parenteral de administração de um medicamento permite que um pirogênio, se presente, contorne as defesas normais do organismo. A resposta do hospedeiro é mediada através dos leucócitos (glóbulos brancos) que, por sua vez, liberam seu próprio tipo de pirogênio (pirogênio endógeno) e isto, por sua vez, inicia a resposta febril e uma infinidade de outras reações biológicas.

Efeitos Biológicos das Endotoxinas

A grande variedade de efeitos biológicos atribuídos aos pirogênios bacterianos tem despertado considerável interesse. \3, 4 As reacções do hospedeiro aos pirogénios são esperadas nas seguintes categorias 1) produção de febre, 2) choque, e 3) alterações nas funções fisiológicas.

Febre é um efeito bem conhecido, daí o termo “pirogénio”. Cerca de uma hora após a injeção de pirogênios em coelhos (ou homem), há um aumento na temperatura corporal. Quando os pirogênios bacterianos são injetados em quantidades suficientes, talvez em quantidades de microgramas, a febre produzida é acompanhada de calafrios, dores no corpo, um aumento da pressão sanguínea e possivelmente um estado de choque e morte. A partir de quantidades menores de injecção, o corpo mostra uma permeabilidade capilar aumentada e uma grande variedade de outras alterações circulatórias. Exemplos destas alterações são mostrados por uma redução seguida por um aumento no número de células brancas, hemorragias tumorais e alterações nas pressões venosas.

Em casos especiais, os pirogénios podem demonstrar o fenómeno de Shwartzman. Esta é uma reação hemorrágica severa com necrose localizada. Pode ser demonstrado em um coelho que primeiro é injetado por via subcutânea com um pirogênio bacteriano, e depois o coelho é injetado por via intravenosa 24 horas depois com o mesmo pirogênio. O local da injeção posterior fica azul no centro e vermelho na periferia.

Tolerância ao pirogênio é outra reação importante que se desenvolve quando os animais recebem injeções repetidas de um pirogênio. Uma sensibilidade reduzida ao mesmo e a outros pirogénios desenvolve-se, o que anula a resposta febril e exige que o animal tolerante seja retirado de mais testes de pirogénio. “Sensibilidade” significa que o animal reage a uma quantidade mínima de material pirogênico. Embora o coelho seja o animal de teste mais utilizado, o homem é considerado o mais sensível aos pirogênios.

Toxinas bacterianas

Existem dois tipos gerais de toxinas bacterianas. \As extoxinas são produzidas durante a fase de crescimento de certos tipos de bactérias e são libertadas para o meio ou tecido. As exotoxinas são proteínas na natureza e as suas reacções são específicas. Por exemplo, Clostridium botulinum produz uma exotoxina de potência incomum que afeta apenas o tecido neurológico. Outros exemplos bem conhecidos de exotoxinas são a toxina do tétano, toxina Shiga e toxina da difteria.

Endotoxinas são outro tipo de toxina que pode ser extraída de uma grande variedade de bactérias gram-negativas. O termo “endotoxina” é geralmente intercambiável com o termo “pirogênio”, embora nem todos os pirogênios sejam endotoxinas e os testes de pirogênio sozinhos não podem ser usados inteiramente para detecção e caracterização de endotoxinas microbianas. São necessárias doses maiores de endotoxinas para produzir um efeito letal no animal experimental do que as necessárias para as exotoxinas. Os efeitos produzidos pelas endotoxinas no hospedeiro são sistêmicos, como febre e reações corporais gerais, ao invés de efeitos estritamente neurológicos, como é o caso da maioria das exotoxinas. As endotoxinas são encontradas principalmente nas bactérias gram-negativas, e são obtidas após a morte e autólise das células. As endotoxinas são extraídas da estrutura celular (parede celular) e associadas a ela. Bons exemplos de bactérias produtoras de pirogênio são S. typhosa, E. coli, e Ps. aeruginosa.

Propriedades adicionais dos pirogênios

Na listagem de propriedades adicionais, pode-se dizer que pirogênios: (1) são conhecidos por consistirem bioquimicamente em uma substância lipídico-polissacarídeo/peptídeo; (2) são estáveis ao calor à temperatura da água fervente; (3) são relativamente baixos em toxicidade aguda para o homem; (4) demonstram uma baixa ordem de resposta imune; e (5) podem ser produzidos a partir de bacteremias gram-negativas persistentes que poderiam ter uma taxa de mortalidade de 50%. \6\

Físicos são instruídos a procurar imediatamente a causa das bacteremias persistentes. Possíveis fontes podem ser a febrebite no local do cateter, equipamento de infusão ou a solução parenteral. É interessante notar que o manejo de pacientes em choque pirogênico inclui a administração de fluidos parenterais (esperançosamente não pirogênicos).

Make It Pyrogen Free

Procedimentos bactericidas como aquecimento, filtração, ou técnicas de adsorção não eliminam os pirogênios das soluções parenterais. Todos os ingredientes devem ser mantidos livres de pirogênios em primeiro lugar. Para esta garantia o fabricante realiza testes abrangentes de triagem de pirogênio em todos os ingredientes da droga parenteral e cuida de seu armazenamento adequado antes do uso. Idealmente, o fabricante reconhece os passos críticos nas operações de fabricação que poderiam permitir o crescimento de bactérias produtoras de pirogênio, e ele monitora essas áreas rotineiramente. Por exemplo, a água nos tanques de retenção seria testada para pirogênios e o fabricante insistiria em tempos mínimos de retenção para que somente água livre de pirogênios seja usada. A água livre de pirogênio, como “água para injeção” descrito no USP, é o coração da indústria parenteral.

Ensaio de Pirogênio – USP

O USP atual delineia claramente o ensaio de pirogênio. A USP XIX considera uma solução pirogênica quando são injetados 10 m1/kg em um coelho e há um aumento de temperatura de 0,6 C ou mais para qualquer coelho, ou um aumento total de mais de 1,4 C para três coelhos em um grupo de teste de três coelhos. O método oficial do coelho requer tempo considerável, gastos, treinamento e experiência para dominar. Há poucos atalhos. A conseqüência de não testar os pirogênios pode ser ainda mais custosa em termos de reações do paciente e de retirada de drogas.

Ensaio de Pirogênios – Lisado Amoebocitário de Limulus

Muitos laboratórios conduzem ensaios de pirogênios por meio do método de teste do Lisado Amoebocitário de Limulus (LAL). \7] O método LAL é útil especialmente para o rastreio de produtos que são impraticáveis de testar pelo método do coelho. Os produtos melhor testados para endotoxinas pelas técnicas LAL são: radiofármacos, anestésicos, e muitos biológicos. Essencialmente, o método LAL reage a hemolinfa (sangue) de um caranguejo ferradura (limulus polyphemus) com uma endotoxina para formar um gel. A quantidade de endotoxina que os géis são determinados a partir de técnicas de diluição comparando a formação de gel de uma amostra de teste com a de um pirogénio de referência, ou a partir de métodos espectrofotométricos comparando a opacidade da formação de gel de uma amostra de teste com aquela opacidade de um pirogénio de referência. O teste LAL é considerado específico para a presença de endotoxinas e é pelo menos cem vezes mais sensível que o teste do coelho. \8, 9, até mesmo quantidades de picogramas de endotoxinas podem ser mostradas pelo método LAL. Embora o LAL seja um método relativamente novo de teste de pirogênio, tem sido mostrada uma grande variedade de derivados polissacarídeos que dão resultados positivos no teste de limulus e também mostram atividade de febre. É também um facto que algumas substâncias interferem com o teste LAL mesmo quando os pirogénios estão presentes.

Algumas empresas utilizam o teste LAL para o rastreio de pirogénios em matérias-primas, e seguem com testes de pirogénio no produto final através do ensaio USP em coelhos. O teste LAL para pirogénios em fármacos requer uma emenda ao NDA com base no produto individual. Os reagentes de teste LAL são licenciados pelo Bureau of Biologics. Para dispositivos, uma empresa deve ter o seu protocolo aprovado pelo Director, Bureau of Medical Devices, antes de poder substituir o ensaio da LAL pelo coelho. \10] O futuro dos testes LAL parece promissor na medida em que está a ser considerado para inclusão na USP, mas não é um método oficial neste momento.

O que é certo é que os pirogénios continuam a ser uma fonte potencial de perigo com o uso da terapia parenteral. A exclusão total de pirogênios requer nossa vigilância contínua em relação à fabricação de medicamentos parenterais. \a)\Parenteral (para = além; enteron = intestino) Não através do trato alimentar, mas por alguma outra via, como subcutânea, intramuscular, intravenosa, intravenosa, intraespinal, etc.

\b)\Pirogênio – um agente produtor de febre de origem bacteriana; endotoxina. Dorland’s Illustrated Medical Dictionary. 25th E.W.B. Saunders, Philadelphia.

1. Singer, Charles Joseph; Underwood, Edgar Ashworth. A Short History of Medicine. 2ª Ed., 1962. Oxford Univ. Press, NY, e Oxford.
2. Hindman, S. H. et al. “Pyrogenic Reactions During Haemodialyzing Caused by Endotoxin.” Lancet 2 (7938): 732-4, Oct. 18, 1975.

li>Kadis, Solomon; Weinbaum, George; Ajl, Samuel J.; Microbial Toxins Vol. IV & V. 1971 Academic Press, NY & London.

3. Davis, Bernard E., et al. Endotoxinas: Textbook of Microbiology, pp 615-7. Quarta impressão. Divisão Médica Hoeber. Harper & Row Publishers, NY.
4. Stainer, Roger Y.; Doudoroff, Michael; Adelberg, Edward A. The Microbial World, Prentice Hall, Inc., 3rd Ed., 1970.

li>Krupp, Marcus A. & Chatton, Milton J.; Current Medical Diagnosis and Treatment. p. 775, Lange Medical Publications, 1975, Los Altos, CA

5. Rastogi, S. C.; Hochstein, H. D.; Seligman, E. B. Jr.; “Statistical Determination of Endotoxin Content in Influenza Virus Vaccine by the Limulus Amoebocyte Lysate Test”. J. Clin Microbiol 6(2): 144-8, Ago. 1977.

li>Nandan, R.; Nakashima, C. Y., Brown, D. R.; “Detection of Endotoxins in Human Blood and Plasma”. Um teste melhorado de pirogênio in-vitro. Clin Chem 23(11): 2080-4 Nov. 1977.li>Wachtel, R. E.; Tskji, K.; “Comparison of Limulus Amoebocyte Lysates and Correlation with the USP Pyrogen Test”. Aplic. Environ. Microbiologia 33(6) 1265-9, Junho 1977.li>Docket No. 77N-0282 como encontrado em FR Doc. 77-31926 Arquivo 11-3-77 (Vol. 42, No. 213 — Sexta-feira, 4 de novembro de 1977) e como encontrado em FR Doc. 78-623 Arquivado 1-12-78 (Vol. 43, No. 9 — Sexta-feira, 3 de janeiro de 1978)/ol>