Vor der Verfügbarkeit von Computern erforderte die Bestimmung der KM- und Vmax-Werte eine algebraische Manipulation der grundlegenden Michaelis-Menten-Gleichung. Da sich Vmax asymptotisch nähert (siehe Abbildung 8.11), ist es unmöglich, aus einem typischen Michaelis-Menten-Diagramm einen endgültigen Wert zu ermitteln. Da KM die Konzentration des Substrats bei Vmax/2 ist, ist es ebenfalls unmöglich, einen genauen Wert für KM zu bestimmen. Vmax kann jedoch genau bestimmt werden, wenn die Michaelis-Menten-Gleichung in eine Gleichung umgewandelt wird, die ein geradliniges Diagramm ergibt. Nimmt man den Kehrwert beider Seiten von Gleichung 23, so erhält man
Eine Darstellung von 1/V0 gegen 1/, die so genannte Lineweaver-Burk- oder doppelt reziproke Darstellung, ergibt eine Gerade mit einem Schnittpunkt von 1/Vmax und einer Steigung von KM/Vmax (Abbildung 8.36). Der Achsenabschnitt auf der x-Achse ist -1/KM.
Abbildung 8.36
Ein doppelt-reziproker oder Lineweaver-Burk-Plot. Die Steigung ist KM/Vmax, der Achsenabschnitt auf der vertikalen Achse ist 1/Vmax und der Achsenabschnitt auf der horizontalen Achse (mehr…)
Doppelreziproke Diagramme sind besonders nützlich, um zwischen kompetitiven und nichtkompetitiven Inhibitoren zu unterscheiden. Bei kompetitiver Inhibition ist der Achsenabschnitt auf der y-Achse des Diagramms von 1/V0 gegen 1/ in Anwesenheit und in Abwesenheit des Inhibitors gleich, obwohl die Steigung größer ist (Abbildung 8.37). Dass der Achsenabschnitt unverändert bleibt, liegt daran, dass ein kompetitiver Inhibitor die Vmax nicht verändert. Bei einer ausreichend hohen Konzentration sind praktisch alle aktiven Stellen mit Substrat besetzt, und das Enzym ist voll funktionsfähig. Die Zunahme der Steigung der Kurve 1/V0 gegen 1/ zeigt die Stärke der Bindung des kompetitiven Inhibitors an. In Anwesenheit eines kompetitiven Inhibitors wird Gleichung 31 ersetzt durch
in dem die Konzentration des Inhibitors und Ki die Dissoziationskonstante des Enzym-Inhibitor-Komplexes ist.
Abbildung 8.37
Kompetitive Hemmung, dargestellt in einem doppelt reziproken Diagramm. Eine doppelt reziproke Darstellung der Enzymkinetik in Anwesenheit (
)und Abwesenheit (
) eines kompetitiven Inhibitors zeigt, dass der Inhibitor keine Auswirkung auf Vmax hat, aber KM erhöht.
Mit anderen Worten, die Steigung der Kurve erhöht sich in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors um den Faktor (1 + /Ki). Betrachten wir ein Enzym mit einem KM von 10-4 M. In Abwesenheit des Inhibitors ist V0 = Vmax/2 bei = 10-4 M. In Gegenwart eines 2 × 10-3 M kompetitiven Inhibitors, der mit einem Ki von 10-3 M an das Enzym gebunden ist, ist das scheinbare KM (KappM ) gleich KM × (1 + /Ki) oder 3 × 10-4 M. Setzt man diese Werte in Gleichung 23 ein, erhält man V0 = Vmax/4, wenn = 10-4 M. Die Anwesenheit des kompetitiven Inhibitors halbiert also die Reaktionsgeschwindigkeit bei dieser Substratkonzentration.
Bei der nichtkompetitiven Hemmung (Abbildung 8.38) kann sich der Inhibitor entweder mit dem Enzym oder dem Enzym-Substrat-Komplex verbinden. Bei der reinen nichtkompetitiven Hemmung sind die Werte der Dissoziationskonstanten von Inhibitor und Enzym sowie von Inhibitor und Enzym-Substrat-Komplex gleich (Abschnitt 8.5.1). Der Wert von Vmax wird auf einen neuen Wert namens Vappmax gesenkt, wodurch der Achsenabschnitt auf der vertikalen Achse erhöht wird. Die neue Steigung, die gleich KM/Vappmax ist, ist um den gleichen Faktor größer. Im Gegensatz zu Vmax wird KM durch reine nichtkompetitive Hemmung nicht beeinflusst. Die maximale Geschwindigkeit in Gegenwart eines reinen nichtkompetitiven Inhibitors, Vimax, ist gegeben durch
Abbildung 8.38
Nicht-kompetitive Hemmung, dargestellt in einem doppelt-reziproken Diagramm. Ein doppelt-reziprokes Diagramm der Enzymkinetik in Anwesenheit (
) und Abwesenheit (
) eines nicht-kompetitiven Inhibitors zeigt, dass KM unverändert und Vmax verringert ist.