óór de beschikbaarheid van computers was voor de bepaling van KM- en Vmax-waarden algebraïsche manipulatie van de basis Michaelis-Menten-vergelijking nodig. Omdat Vmax asymptotisch benaderd wordt (zie figuur 8.11), is het onmogelijk om een definitieve waarde te verkrijgen uit een typische Michaelis-Menten-plot. Omdat KM de concentratie van het substraat bij Vmax/2 is, is het evenmin mogelijk een nauwkeurige waarde van KM te bepalen. Vmax kan echter wel nauwkeurig worden bepaald als de Michaelis-Menten-vergelijking wordt omgezet in een vergelijking die een rechtlijnig diagram oplevert. De reciproke van beide zijden van vergelijking 23 nemen geeft
Een plot van 1/V0 versus 1/, Lineweaver-Burk of dubbel-reciprocal plot genoemd, geeft een rechte lijn met een intercept van 1/Vmax en een helling van KM/Vmax (figuur 8.36). Het intercept op de x-as is -1/KM.
Figuur 8.36
Een dubbel-reciproke of lineweaver-burkplot. Een dubbel-reciproke plot van de enzymkinetiek wordt verkregen door 1/V0 uit te zetten als een functie 1/. De helling is de KM/Vmax, het intercept op de verticale as is 1/Vmax, en het intercept op de horizontale as (meer…)
Dubbel-reciproke plots zijn vooral nuttig om onderscheid te maken tussen competitieve en niet-competitieve remmers. Bij competitieve remming is het intercept op de y-as van de plot van 1/V0 versus 1/ hetzelfde in aanwezigheid en in afwezigheid van de remmer, hoewel de helling groter is (figuur 8.37). Dat het intercept onveranderd blijft, komt doordat een competitieve remmer de Vmax niet verandert. Bij een voldoende hoge concentratie zijn vrijwel alle actieve plaatsen gevuld met substraat, en is het enzym volledig werkzaam. De toename van de helling van de grafiek 1/V0 versus 1/ geeft de sterkte van de binding van de competitieve remmer aan. In de aanwezigheid van een competitieve remmer wordt vergelijking 31 vervangen door
waarin de concentratie van de remmer en Ki de dissociatieconstante van het enzym-remmer complex is.
Figuur 8.37
Competitive Inhibition Illustrated on a Double-Reciprocal Plot. Een dubbel-reciproke plot van de enzymkinetiek in aanwezigheid (
)en afwezigheid (
) van een competitieve remmer laat zien dat de remmer geen effect heeft op de Vmax, maar de KM verhoogt.
Met andere woorden, de helling van de plot neemt toe met de factor (1 + /Ki) in aanwezigheid van een competitieve remmer. Beschouw een enzym met een KM van 10-4 M. In afwezigheid van een remmer is V0 = Vmax/2 wanneer = 10-4 M. In aanwezigheid van 2 × 10-3 M competitieve remmer die aan het enzym is gebonden met een Ki van 10-3 M, zal de schijnbare KM (KappM ) gelijk zijn aan KM × (1 + /Ki), ofwel 3 × 10-4 M. Substitutie van deze waarden in vergelijking 23 geeft V0 = Vmax/4, wanneer = 10-4 M. De aanwezigheid van de competitieve remmer halveert dus de reactiesnelheid bij deze substraatconcentratie.
Bij niet-competitieve remming (figuur 8.38) kan de remmer zich zowel met het enzym als met het enzym-substraatcomplex verbinden. Bij zuivere niet-competitieve remming zijn de waarden van de dissociatieconstanten van de remmer en het enzym en van de remmer en het enzym-substraatcomplex gelijk (paragraaf 8.5.1). De waarde van Vmax wordt verlaagd tot een nieuwe waarde, Vappmax genaamd, en dus wordt het intercept op de verticale as verhoogd. De nieuwe helling, die gelijk is aan KM/Vappmax, is met dezelfde factor groter. In tegenstelling tot Vmax wordt KM niet beïnvloed door zuivere niet-competitieve remming. De maximale snelheid in aanwezigheid van een zuivere niet-competitieve remmer, Vimax, wordt gegeven door
Figure 8.38
Noncompetitive Inhibition Illustrated on a Double-Reciprocal Plot. Een dubbel-reciproke plot van de kinetiek van het enzym in aanwezigheid (
) en afwezigheid (
) van een niet-competitieve remmer laat zien dat KM onveranderd is en Vmax is afgenomen.