Burden of Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii Infection in Hospitalized Patients in a Tertiary Care Hospital of Nepal

Introduction

Acinetobacter baumannii is een aerobische, niet-fermentatieve, gramnegatieve, niet-motiele, cocco-bacillen die een aantal effectieve virulentiefactoren herbergen.1 Het organisme is in staat te overleven onder een breed scala van omgevingsomstandigheden en blijft gedurende langere tijd op oppervlakken aanwezig, waardoor het een frequente oorzaak is van het uitbreken van infecties en zorginfecties.2 Het belangrijkste probleem dat A. baumannii in de ziekenhuissetting veroorzaakt, betreft meestal ernstig zieke patiënten op intensive care units (ICU’s), met name patiënten die mechanische beademing nodig hebben, en patiënten met wond- of brandwondletsel. Infecties geassocieerd met A. baumannii omvatten ventilator-geassocieerde pneumonie, huid- en weke delen infecties, wondinfecties, urineweginfecties, secundaire meningitis, en bloedstroominfecties.3

Acinetobacter baumannii is wereldwijd opgekomen als een belangrijke MDR nosocomiale ziekteverwekker en is het laatste decennium in toenemende mate gerapporteerd, waarschijnlijk als gevolg van het toenemende gebruik van breedspectrum antibiotica bij gehospitaliseerde patiënten.4 De Infectious Diseases Society of America (ISDA) heeft A. baumannii aangewezen als een van de “red alert” ziekteverwekkers die een grote bedreiging vormen voor de bruikbaarheid van ons huidige antibacteriële arsenaal.5 Talrijke studies hebben een stijgende trend in de prevalentie van MDR A. baumannii aangetoond, maar de resistentiepercentages kunnen sterk variëren naargelang het betrokken ziekenhuis, stad of land. Omdat MDR Acinetobacter-infectie meestal optreedt bij ernstig zieke patiënten, is de bijbehorende ruwe mortaliteit hoog, variërend van 26% tot 68%.6

Multiresistente A. baumannii heeft resistentie ontwikkeld tegen de meeste beschikbare antibiotica, waaronder carbapenems, die de geneesmiddelen bij uitstek zijn bij de behandeling van ernstige infecties.7 Het voornaamste mechanisme voor β-lactamresistentie bij A. baumannii komt overeen met effluxpompen, porinemutaties en de productie van verworven β-lactam hydrolyserende enzymen, d.w.z. klasse A (extended-spectrum β-lactamases, ESBL’s), klasse B (metallo-β-lactamases, MBL’s), klasse C Ampicillinase (AmpC), alsook klasse D β-lactamases. Carbapenemresistentie als gevolg van MBL- en andere carbapenemasenproductie kan zich snel verspreiden in ziekenhuisomgevingen, aangezien deze vaak plasmide-gemedieerd is en vroege detectie van geneesmiddelenresistentie noodzakelijk is voor de juiste selectie van antibiotica om A. baumannii infecties bij gehospitaliseerde patiënten te behandelen en om effectieve infectiecontrolemaatregelen te initiëren om de verspreiding ervan in ziekenhuisomgevingen te voorkomen.8,9

Met het bovenstaande in gedachten werd de studie uitgevoerd op A. baumannii geïsoleerd uit gehospitaliseerde patiënten om hun antibiotica-gevoeligheidspatronen te bepalen, MDR-stammen te identificeren en verschillende β-lactamases te detecteren onder MDR-isolaten.

Materialen en methoden

De laboratoriumgebaseerde studie werd uitgevoerd op de afdeling Klinische Microbiologie, Tribhuvan University Teaching Hospital (TUTH), een tertiair zorgcentrum van Nepal van januari 2017 tot december 2017 (over een periode van 12 maanden). Alle klinische specimens verzameld van de gehospitaliseerde patiënten verdacht van infecties die verschillende lichaamslocaties vertegenwoordigen (sputum, bronchoalveolaire lavage, endotracheaal aspiraat, pus en swab specimens, verschillende lichaamsvloeistoffen, urine, bloed, katheter tips, enz.) werden verwerkt volgens standaard microbiologische methoden aanbevolen door American Society for Microbiology (ASM) voor isolatie en identificatie van A. baumannii.10

Antibiotic Susceptibility Testing (AST)

De gevoeligheid van A. baumannii isolaten tegen verschillende antibiotica werd bepaald door de gemodificeerde Kirby-Bauer schijfdiffusiemethode op Mueller-Hinton agar en geïnterpreteerd volgens standaardprocedures aanbevolen door het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), Wayne, USA.11 Het antibioticagevoeligheids profiel van alle isolaten van A. baumannii werd bepaald door te testen tegen ampicilline-sulbactam (10/10 μg), ceftazidime (30 μg), gentamicine (10 μg), ciprofloxacine (5 μg), levofloxacine (5 μg), meropenem (10 μg), en imipenem (10 μg). De isolaten die resistent waren tegen ten minste één antimicrobieel middel uit drie verschillende groepen van bovengenoemde antibiotica (d.w.z. MDR-isolaten) werden ook getest tegen piperacilline (100 μg), piperacilline-tazobactam (100/10 μg) cefotaxime (30 μg), cefepime (30 μg), cotrimoxazol (25 μg), amikacine (30 μg), doxycycline (30 μg), polymyxine B (300 eenheden), en colistinesulfaat (10 μg) van HiMedia Laboratories, India.

Identificatie van MDR-isolaten

Multiresistente A. baumannii isolaten werden geïdentificeerd volgens de richtlijnen aanbevolen door het European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). De isolaten die niet gevoelig waren voor ten minste één antimicrobiële stof in drie of meer antimicrobiële klassen werden geïdentificeerd als MDR.12

Detectie van producenten van Extended-Spectrum β-Lactamase (ESBL)

De initiële screeningstest voor de productie van ESBL werd uitgevoerd door te testen met ceftazidime (CAZ, 30 μg) en cefotaxime (CTX, 30 μg) disks. De isolaten werden als potentiële ESBL-producenten beschouwd wanneer de remmingszone (ZOI) <18 mm voor CAZ of <23 mm voor CTX bedroeg. Isolaten die er met de screentest van verdacht werden ESBL-producenten te zijn, werden verder getest met de combischijfmethode (CD) ter bevestiging van de ESBL-productie, waarbij CAZ en CTX alleen en in combinatie met clavulaanzuur werden gebruikt. Na incubatie gedurende 16-18 uur bij 35±2°C werd een toename van de ZOI van ≥5 mm voor een van beide antimicrobiële middelen in combinatie met clavulaanzuur in vergelijking met de remmingszone wanneer alleen getest, bevestigd als positieve ESBL-producenten.11

Detectie van AmpC β-lactamase-producenten

Acinetobacter baumannii die een remmingszone <18 mm voor cefoxitine (CX, 30 μg) schijf produceerde, werd getest op AmpC β-lactamase-productie. AmpC β-lactamase werd opgespoord met de AmpC-schijfjestest. Bij deze methode werd een cefoxitine-gevoelige Escherichia coli-indicatorstam (ATCC 25922) geënt op een standaard MHA-plaat om een gazonkweek te vormen en werd een cefoxitineschijf geplaatst. Een blanco schijf met een diameter van 6 mm, bevochtigd met Tris-EDTA-buffer, werd geënt met enkele kolonies van de teststam en naast de cefoxitineschijf gelegd. De platen werden ’s nachts bij 37°C geïncubeerd. Na de nachtelijke incubatie werd een inkeping in de remmingszone van cefoxitine naast de schijf met de teststam als positief beschouwd voor AmpC β-lactamaseproductie.13

Detectie van producenten van Metallo β-Lactamase (MBL) en Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC)

De isolaten werden onderworpen aan de detectie van MBL- en KPC-productie wanneer ze resistent waren tegen meropenem (MEM, 10 μg). De gecombineerde meropenemschijfmethode werd toegepast voor detectie en differentiatie van MBL, KPC of co-producent van KPC/MBL zoals beschreven door Tsakris et al14 In deze test werden vier schijven gebruikt; (a) MEM = een gewone MEM-schijf (10 μg), b) MEM+EDTA = MEM-schijf (10 μg) met 292 μg EDTA, c) MEM+fenylboronzuur (PBA) = MEM-schijf (10 μg) met 400 μg PBA, en d) MEM+EDTA+PBA = MEM-schijf (10 μg) met zowel 292 μg EDTA als 400 μg PBA. EDTA werkt als een remmer van MBL terwijl PBA een remmer van KPC is. De test werd uitgevoerd door een Mueller-Hinton agar te enten met testorganisme zoals aangegeven voor de standaard diffusiemethode en er werden vier schijven op aangebracht. Na incubatie gedurende een nacht bij 37°C werd de ZOI-diameter rond de MEM+EDTA-, MEM+PBA-, en MEM+EDTA+PBA-schijven vergeleken met die rond de gewone MEM-schijf. Productie van MBL werd beschouwd wanneer de ZOI-diameter rond de MEM+EDTA- en MEM+EDTA+PBA-schijven ≥5 mm groter was dan de ZOI-diameter rond de MEM-schijf alleen. De productie van KPC werd geacht plaats te vinden wanneer de ZOI-diameter rond de MEM+PBA- en MEM+EDTA+PBA-schijven ≥ 5 mm groter was dan de ZOI-diameter rond de MEM-schijf alleen. De coproductie van zowel KPC als MBL enzymen werd beschouwd wanneer de ZOI-diameter rond de MEM+EDTA+PBA schijven ≥5 mm groter was dan de ZOI-diameter rond de MEM-schijf alleen. Opgemerkt moet worden dat de concentratie PBA en EDTA die in de huidige studie werd gebruikt, geen aantoonbaar effect op de bacteriegroei vertoonde.

Gegevensverwerking en analyse

Gegevens met betrekking tot patiëntdemografie, specimens, afdelingen, antibacteriële profielen, resistentiebepalende factoren werden geanalyseerd met SPSS 16.0 versie en geïnterpreteerd aan de hand van frequentieverdeling en percentage.

Resultaten

Tijdens de studieperiode werden in totaal 177 A. baumannii geïsoleerd. Van de in totaal A. baumannii isolaten werden de meeste (N=161, 91,0%) geïdentificeerd als MDR.

Distributie van MDR Acinetobacter baumannii

Van de 161 MDR isolaten werd de meerderheid (47.2%) geïsoleerd uit monsters van de luchtwegen (d.w.z. sputum, bronchoalveolaire lavage en tracheaal aspiraat), gevolgd door pus en swabs, lichaamsvloeistoffen, urine, bloed en het minst uit katheterpunten (1,2%) (tabel 1). Van het totaal aantal MDR-isolaten was 58,3% afkomstig van mannelijke en 41,7% van vrouwelijke patiënten, met een man-vrouwverhouding van 1,4. The highest number of isolates were from male patients with age group ≥65 years (14.9%) and the least number was isolated from a female patient with age group 49–64 years (5.0%) (Table 2). Similarly, the higher number of MDR isolates were isolated from ICU patients (49.6%) followed by surgical wards (19.9%) and medical wards (14.3%), while the lowest number from burn wards (1.9%) (Table 3).

Table 1 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii in Various Clinical Specimens

Table 2 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii by Gender and Age Group of Patients

Tabel 3 Distributie van MDR Acinetobacter baumannii naar afdeling

Antibiogram van MDR Acinetobacter baumannii

Het antibioticagevoeligheidsprofiel laat zien dat de meeste MDR-isolaten resistent waren tegen de meeste eerstelijnslijn antibiotica. Onder hen waren alle isolaten volledig resistent tegen piperacilline en cefotaxime. Evenzo was 99,4% resistent tegen ceftazidime en cefepime, 98,7% tegen cotrimoxazol, 95% tegen piperacilline-tazobactam en ciprofloxacine, 93,8% tegen gentamicine, 89,4% tegen ampicilline-sulbactam en meropenem. Slechts 11,8%, 12,4%, 13,6%, en 37,9% waren gevoelig voor respectievelijk levofloxacine, imipenem, amikacine, en doxycycline. Alle MDR-isolaten waren volledig gevoelig voor alleen de laatste redmiddelantibiotica, d.w.z. polymyxine B en colistinesulfaat (figuur 1).

Figure 1 Percentage of antimicrobial resistance and sensitivity of MDR A. baumannii (N = 161).

ESBL, AmpC, MBL, and KPC Production in MDR Acinetobacter baumannii

In this study, the rate of β-lactamases production among MDR isolates was significantly high. MBL was the common β-lactamase detected among MDR A. baumannii (67.7%). ESBL was detected in 19.9%, AmpC in 38.5%, and KPC in 9.3% of MDR isolates. The co-production of different types of β-lactamases was also seen among some isolates. ESBL+AmpC co-producers were seen in 6.8%, ESBL+MBL co-producers in 5.0%, AmpC+MBL co-producers in 23.0% and MBL+KPC in 5.6% of MDR isolates (Table 4).

Table 4 β-Lactamasenproductie bij MDR Acinetobacter baumannii

Discussie

Acinetobacter baumannii is een belangrijke nosocomiale ziekteverwekker die in verband wordt gebracht met een grote verscheidenheid aan ziekten bij ziekenhuispatiënten, met name op intensivecareafdelingen, wat een grotere uitdaging vormt voor het beheer van de patiënt en de infectiebestrijding. De wereldwijde opkomst van MDR A. baumannii isolaten baart grote zorgen.15

In onze studie werd MDR A. baumannii vaak geïsoleerd uit specimens van de luchtwegen (47,2%), gevolgd door pus en swabs (27,3%), lichaamsvloeistoffen (11,1%) en andere. Een studie werd gedaan door Shrestha et al in 201515 uit hetzelfde ziekenhuis rapporteerde ook 49,18% van de MDR A. baumannii uit respiratoire tractus specimens en Samawi et al16 uit Qatar rapporteerden 48,9% A. baumannii uit respiratoire tractus infectie. De demografische gegevens in onze studie toonden aan dat een hoge prevalentie van infecties bij mannelijke patiënten met een leeftijd ≥65 jaar en een groot deel van de MDR-isolaten afkomstig was van ICU-patiënten, omdat deze bacterie een voorkeur heeft voor hogere leeftijdsgroepen en ernstig zieke ICU-patiënten.

Het percentage MDR A. baumannii in onze studie is 91,0%, wat zeer hoog is. Ook in de studie van Shrestha et al. en Mishra et al. waren respectievelijk ongeveer 96% en 95% van de A. baumannii MDR.17,18 Deze hoge prevalentie van MDR A. baumannii kan te wijten zijn aan de grote kans op verspreiding van resistentiegenen en hun vermogen om overal in de ziekenhuisomgeving aanwezig te zijn. De A. baumannii infectie met hoge MDR isolaten heeft ons ook gealarmeerd dat er verdere behoefte is aan uitgebreide studie en toepassing van preventieve maatregelen om een dergelijke angstige bedreiging bij gehospitaliseerde patiënten te verminderen. Multidrug-resistente A. baumannii isolaten werden in deze studie significant resistent bevonden tegen carbapenems, aminoglycosiden, en fluoroquinolone groepen van antibiotica. Bijna alle MDR-isolaten waren resistent tegen piperacilline en cefalosporines, 93,8% tegen gentamycine en 89,4% tegen meropenem, wat hoger is dan gerapporteerd door Mishra et al18 uit hetzelfde ziekenhuis (bijna 89% en 50% isolaten waren resistent tegen cefalosporines en carbapenem, respectievelijk). Een studie van Xia et al in China toonde carbapenemresistentie aan in 85% van de isolaten, wat bijna vergelijkbaar is met deze studie.19 Het MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) programma van 2007 toonde aan dat 74,1% van de isolaten vatbaar waren voor meropenem en 78,9% voor imipenem in Europa, vergeleken met veel lagere gevoeligheden van 51,3% en 52,0% in verschillende Aziatische landen.20,21 Ons resultaat over het resistentiepercentage tegen amikacine was 86.3%, wat hoger is dan 54% in de vorige studie uit hetzelfde ziekenhuis.18 De toenemende opkomst van zeer aminoglycosideresistente stammen is ook een reden tot grote bezorgdheid. In deze studie waren 95,0% en 88,2% MDR A. baumannii resistent tegen respectievelijk ciprofloxacine en levofloxacine. De resistentie tegen fluorochinolonen neemt de laatste jaren snel toe in klinische isolaten vanwege hun wijdverbreide gebruik in de klinische geneeskunde als breedspectrum antimicrobiële middelen. In onze studie vertoonden polymyxine B en colistinesulfaat een uitstekend effect tegen MDR A. baumannii, aangezien geen van de isolaten resistent werd bevonden tegen colistinesulfaat en polymyxine B. Maar in de studie van Joseph et al22 en Al-Sweih et al,23 waren respectievelijk 20% en 12% Acinetobacter spp. resistent tegen colistinesulfaat. De huidige studie heeft echter een hoog percentage antibioticaresistentie tegen veelgebruikte antibiotica aangetoond en dat is een nadeel voor de gezondheidszorg in landen als Nepal, omdat het de behandeling van de patiënt sterk kan beïnvloeden. Dit kan te wijten zijn aan het intensieve gebruik van de antimicrobiële middelen in het ziekenhuis, de gemakkelijke beschikbaarheid en het ongedifferentieerde gebruik van deze geneesmiddelen buiten de ziekenhuizen, en veel antibiotica zijn over de toonbank verkrijgbaar voor zelfmedicatie. De ontwikkeling van antibioticaresistentie wordt geassocieerd met een hoge morbiditeit en mortaliteit bij gehospitaliseerde patiënten, vooral op de IC.

De verminderde gevoeligheid van A. baumannii voor de derde generatie en vierde generatie cefalosporines zou kunnen worden toegeschreven aan ESBL of AmpC β-lactamase producenten of andere relevante onderliggende mechanismen. Uit deze studie bleek dat 19,9% van de MDR A. baumannii ESBL-producent was. Een soortgelijk percentage ESBL werd aangetroffen in een eerdere studie van Parajuli et al bij IC-patiënten.24 In de studie van Mishra et al,18 was slechts 12,9% van de Acinetobacter spp. ESBL-producenten. In een Indiaas onderzoek25 was slechts 7% van de A. baumannii isolaten ESBL-producent, terwijl een ander onderzoek uit India8 29,9% van de Acinetobacter spp. als ESBL-producent documenteerde. Studies hebben aangetoond dat de prevalentie van ESBL van land tot land en van instelling tot instelling verschilt, zowel voor nosocomiale als voor gemeenschapsisolaten. Dit kan worden toegeschreven aan de gewoonten om antibiotica voor te schrijven en de aanwezigheid van ziekteverwekkers die de genen voor ESBL-productie herbergen. Hoewel er geen CLSI richtlijnen zijn voor de detectie van de AmpC β-lactamases productie, hebben wij de AmpC disk test gevolgd.13 In de huidige studie werd de prevalentie van AmpC producerende MDR A. baumannii gevonden op 35,6%. Bijna een vergelijkbare prevalentie van AmpC-producerende Acinetobacter spp. is gerapporteerd uit hetzelfde ziekenhuis door Parajuli et al24 Echter, in een Indiase studie werd een hoger percentage (56%) AmpC-producerende A. baumannii gedocumenteerd.26

Carbapenem-resistente Acinetobacter baumannii (CRAB) is opgenomen in prioriteit 1 (d.w.z. kritiek) van een wereldwijde prioriteitenlijst van antibioticaresistente bacteriën om richting te geven aan onderzoek, ontdekking en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen door de Wereldgezondheidsorganisatie.27 Hoewel er verschillende mechanismen zijn voor carbapenemresistentie, is de productie van carbapenemase-enzymen het meest effectieve mechanisme.9 De opkomst van MBL’s in A. baumannii wordt een therapeutische uitdaging, aangezien deze enzymen een hoge hydrolytische activiteit bezitten die leidt tot afbraak van cefalosporines van hogere generaties en carbapenems. Bovendien verspreiden plasmide-gemedieerde MBL-genen zich snel naar andere soorten gramnegatieve bacillen.28 Daarom is een snelle detectie van MBL-productie noodzakelijk om de therapie aan te passen en een effectieve infectiebestrijding in te stellen om de verspreiding ervan te voorkomen. In de huidige studie bleken metallo β-lactamase (MBL) producerende isolaten vaker voor te komen dan ESBL- en AmpC-producenten, waarbij 67,7% MDR A. baumannii MBL-producenten waren. In Nepal zijn weinig studies gedaan naar de prevalentie van MBL’s, Shrestha et al29 rapporteerden 47,2% en Parajuli et al24 rapporteerden 78,8% MBL-producenten bij Acinetobacter spp. uit hetzelfde ziekenhuis. In de studie van Dey en Bairy30 werd MBL slechts in 21,7% van de Acinetobacter spp. aangetroffen. Het naast elkaar voorkomen van meerdere MBL-genen in bacteriën is een alarmerende situatie. Aangezien MBL-genen geassocieerd zijn met integronen die kunnen worden ingebed in transposons, die op hun beurt kunnen worden ondergebracht op plasmiden, waardoor een zeer mobiel genetisch apparaat ontstaat, is de kans groot dat deze genen zich verder verspreiden in verschillende pathogenen. In deze studie werd ook getracht de KPC-producerende isolaten te achterhalen, waarbij 9,5% MDR A. baumannii en sommigen van hen ook MBL-enzym co-produceerden. Hoewel er geen enkel artikel was over de detectie van KPC in Nepal, rapporteerden Parajuli et al24 onlangs KPC-producerende Acinetobacter-soorten van ICU-patiënten. De meeste KPC-producerende isolaten zijn gemeld uit de VS, Griekenland, China, Israël en Colombia.31 Onder de carbapenemases heeft KPC een hoge frequentie en wordt het vaak aangetroffen in Klebsiella pneumonia.32 Onder de β-lactamases producerende isolaten waren sommige isolaten ook co-producenten van verschillende β-lactamases en de MDR-isolaten die twee verschillende soorten β-lactamases produceerden, vertoonden een hoog resistentieprofiel. De verspreiding van carbapenemase-producerende bacteriën over de wereld in de afgelopen jaren is beschouwd als een grote bedreiging voor de volksgezondheid. Nadat de carbapenem-resistente klonen zijn opgedoken, blijft de hoop op behandeling van MDR A. baumannii infectie over door het laatste redmiddel van potentieel toxische antibiotica zoals polymyxine B en colistinesulfaat.33

De studie toont aan dat infectie met MDR A. baumannii in een alarmerend tempo toeneemt in ons ziekenhuis. Het is nu van groot belang geworden om deze situatie onder controle te krijgen voordat deze een dodelijke vorm aanneemt. Daarom is een snelle opsporing van de resistentie determinanten noodzakelijk om de therapie aan te passen en een effectieve infectiebestrijding te starten om de verspreiding ervan te voorkomen.

Beperkingen

We konden de risicofactoren en uitkomsten van MDR A. baumannii infecties bij gehospitaliseerde patiënten niet evalueren vanwege het niet beschikbaar zijn van voldoende gegevens van de patiënten. Bovendien werd de genetische analyse van de resistente fenotypes en mechanismen van geneesmiddelenresistentie niet bepaald.

Conclusie

Uit de huidige studie blijkt dat infecties bij gehospitaliseerde patiënten ten gevolge van MDR A. baumannii vaak voorkomen. Het percentage MBL, ESBL en AmpC productie onder de MDR isolaten is sterk toegenomen en deze bacteriën kunnen leiden tot een hoge morbiditeit en mortaliteit omdat we alleen nog maar kunnen behandelen met potentieel toxische antibiotica zoals colistinesulfaat en polymyxine B en dit is het vervelende probleem voor gehospitaliseerde patiënten. Vastgestelde aanbevelingen, waaronder een goede opsporing van geneesmiddelenresistentie bij ziekteverwekkers, een antimicrobieel beperkingsbeleid om overmatig gebruik van breedspectrumantibiotica te vermijden, verbetering van resistentiesurveillancesystemen en strenge infectiecontrolemaatregelen zullen helpen deze situatie onder controle te krijgen.