Distinct fibroblast subsets regulate lacteal integrity through YAP/TAZ-induced VEGF-C intestinal villi

Experimentele dieren

Alle dierverzorging en experimentele procedures voldeden aan alle ethische regels voor dieronderzoek en testen onder goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (No. KA2016-12) van Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 en Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 muizen werden overgebracht, vastgesteld, en gefokt in specifieke pathogeen-vrije (SPF) dierfaciliteiten bij KAIST. C57BL / 6 J, R26-tdTomato en Myh11-Cre-ERT2 muizen werden gekocht van het Jackson Laboratory. Alle muizen werden gehouden in de C57BL / 6 achtergrond en gevoed met vrije toegang tot een standaard dieet (PMI LabDiet) en water. Om Cre activiteit in de Cre-ERT2 muizen te induceren, werd 2 mg tamoxifen (Sigma-Aldrich) opgelost in maïsolie (Sigma-Aldrich) intraperitoneaal (i.p.) geïnjecteerd op aangegeven tijdstippen voor elk experiment. Cre-ERT2 negatieve maar flox / flox-positieve muizen onder de nestgenoten werden gedefinieerd als controle (WT) muizen voor elk experiment. Muizen werden verdoofd met i.p. injectie van een combinatie van anesthetica (80 mg / kg ketamine en 12 mg / kg xylazine) voordat ze werden opgeofferd.

Histologische analyses

Voor whole-mount kleuring van dunne darm, transcardiale perfusie werd uitgevoerd met 2% paraformaldehyde (PFA) na anesthesie. Dunne darm werd geoogst en in de lengte doorgesneden om het lumen bloot te leggen. Na verschillende wasbeurten met PBS, werden de darmen vastgepind op siliconen platen. De monsters werden vervolgens gedurende 2 uur nagefixeerd bij 4 °C in 4% PFA. De monsters werden verscheidene malen gewassen met PBS en vervolgens gedehydrateerd met 10% sucrose in PBS gedurende 2 uur en met 20% sucrose, 10% glycerol in PBS gedurende een nacht. Oorhuid, luchtpijp en diafragma werden geoogst zonder transcardiale perfusie en gefixeerd in 4% PFA gedurende 1 uur bij 4 ° C. De monsters werden verschillende malen gewassen met PBS alvorens te blokkeren. Na blokkeren met 5% geiten- of ezelserum in 0,5% Triton-X 100 in PBS (PBST) gedurende 1 uur, werden de monsters geïncubeerd met de aangegeven primaire antilichamen verdund in de blokkeeroplossing bij 4 °C gedurende 1 nacht. Na verschillende keren wassen met PBST werden de monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) geïncubeerd met de aangegeven fluorocroom-geconjugeerde secundaire antilichamen, verdund in de blokkeerbuffer. De monsters werden gewassen met PBST en de kernen werden gekleurd met DAPI (Invitrogen). Na het wassen met PBS werden de monsters gemonteerd met Vecta-shield (Vector Laboratories). Beelden werden verkregen met behulp van Zeiss LSM 800 of LSM 880 confocale microscoop (Carl Zeiss).

De volgende primaire en secundaire antilichamen werden gebruikt in de immunokleuring: anti-LYVE-1 (konijn polyklonaal, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (rat monoklonaal, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (hamster monoklonaal, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-cadherine (geiten polyklonaal, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (geiten polyklonaal, AF2727, R&D, 1:200); anti-Prox1 (geiten polyklonaal, AF2727, R&D, 1:200):400); anti-Prox1 (konijn polyklonaal, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anti-VE-cadherine (geiten polyklonaal, AF1002, R&D, 1:200); anti-PDGFRβ (rat monoklonaal, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (muizenmonoklonaal, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (geitenpolyklonaal, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (konijnenmonoklonaal, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (konijn polyklonaal, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (konijn polyklonaal, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (konijn polyklonaal, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (konijn polyklonaal, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200):200); anti-Grem1 (geitenpolyklonaal, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (konijnenpolyklonaal, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (geitenpolyklonaal, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (konijnenpolyklonaal, ab30455, Abcam, 1:400); anti-YAP (geitenpolyklonaal, AF1062, R&D, 1:200):1000); anti-VEGFR3 (geitenpolyklonaal, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (geitenpolyklonaal, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (konijnmonoklonaal, 13179, Cell signaling, 1:400); anti-F4/80, FITC-geconjugeerd (rattenmonoklonaal, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (hamstermonoklonaal, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmin (konijnpolyklonaal, AB907, Millipore, 1:200); en Alexa Fluor, 1:400):400); en Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-geconjugeerde anti-rabbit, anti-rat, anti-geit, anti-hamster secundaire antilichamen (verdund in een verhouding van 1:1000) werden gekocht bij Jackson ImmunoResearch. Alle in onze studie gebruikte antilichamen werden gevalideerd voor de soorten en toepassingen.

Single-molecule fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH)

Voor smFISH van dunne darm, transcardiale perfusie werd uitgevoerd met 2% PFA na anesthesie. Monsters werden nagefixeerd bij 4 ° C in 4% PFA gedurende 2 uur. Monsters werden gewassen met PBS meerdere malen, overgebracht naar 30% sucrose, en ’s nachts geïncubeerd. De in OCT ingebedde monsters werden gesneden, en we voerden de smFISH uit volgens het protocol van de fabrikant dat is beschreven in de RNAscope Fluorescente Multiplex Assay kit (320850, ACDBio). De RNA scope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) werd gebruikt voor smFISH. De volgende primaire en secundaire antilichamen werden gebruikt bij de immunokleuring met smFISH: anti-PDGFRβ (rat monoklonaal, ab91066, Abcam); anti-Shisa3 (konijn polyklonaal, TA320118, Origene); anti-P2X1 (konijn polyklonaal, APR-001, Alomone labs) en Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-geconjugeerde secundaire antilichamen werden aangekocht bij Jackson ImmunoResearch. Beelden werden verkregen met behulp van Zeiss LSM 800 of LSM 880 confocale microscoop (Carl Zeiss).

EdU incorporatie assay voor prolifererende LECs

Om prolifererende LECs in lacteal te detecteren, werd 5 mg 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU, A10044, Invitrogen) opgelost in 1 ml Milli-Q water als een voorraadoplossing. Vervolgens werd 200 ul van de stockoplossing per muis geïnjecteerd i.p. om de andere dag gedurende een week voor de analyse. Dunne darm werd geïsoleerd en verwerkt zoals hierboven beschreven. EdU-geïncorporeerde cellen werden gedetecteerd met de Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant.

Elektronenmicroscopie

Om ultrastructurele elektronenmicroscopische beelden van lacteal vast te leggen, werd dunne darm doorgesneden na transcardiale perfusie met 4% PFA en 0,25% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4). Monsters werden vervolgens ’s nachts gefixeerd in 2,5% glutaaraldehyde, nagefixeerd met 1% osmiumtetroxide, en gedehydrateerd met een reeks van toenemende ethanolconcentraties, gevolgd door hars inbedding. 70-nm ultradunne melkzuur secties werden verkregen met behulp van een ultramicrotoom (UltraCut-UCT, Leica), die vervolgens werden verzameld op koperen roosters. Monsters werden afgebeeld met transmissie EM (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) bij 120 kV na kleuring met 2% uranylacetaat en loodcitraat.

Intravitale beeldvorming van lipide klaring van lamina propria

Muizen werden verdoofd na het verwijderen van voedsel voor 12 uur voor de procedure. Intravitale beeldvorming werd uitgevoerd zoals we eerder beschreven34. Kortom, BODIPY lipide probes (0,1 mg / ml, Thermo Fisher) werden opgelost in 2,5% DMSO-oplossing (Sigma-Aldrich). Anti-LYVE-1 (rat monoklonale, 223322, R&D) geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (Invitrogen) antilichaam (0,75 mg / kg) werd intraveneus geïnjecteerd op 12 uur voor de beeldvorming voor fluorescerende etikettering van lacteals. Vervolgens werd de proximale jejunum geëxternaliseerd in een beeldvormende kamer waar de temperatuur werd gehandhaafd op 37 ° C tijdens de beeldvorming. Na chirurgische opening van de darmlumen 1,5 cm langs de anti-mesenterische grens, werd een dekglas geplaatst op de blootgestelde lumen tot een villi bekijken te verkrijgen. De intravitale beeldvorming werd gedaan over drie sessies. De darmvlokken werden eerst afgebeeld voordat de BODIPY-FA levering op 0 min. Dan 30 ul van BODIPY lipide probes werden eenmaal geleverd voor de tweede beeldvormende sessie om de eerste BODIPY lipide absorptie te observeren op 1 min. Vervolgens werden de BODIPY lipiden geleverd drie keer met 2 min intervallen voor de derde beeldvormende sessie op 26 min, en BODIPY-FA clearing door lacteals werd geanalyseerd op 36 min en 46 min. Een zelf gebouwde video-rate laser-scanning confocale microscoop werd gebruikt 34. Twee continu-golf lasers emitteren bij 488 nm (MLD, Coherent) en 640 nm (Cube, Coherent) werden gebruikt als excitatie bronnen voor fluorescentie beeldvorming. Twee bandpass filters (FF01-525/50 en FF01-685/40, Semrock) werden gebruikt voor de detectie van fluorescerende signalen. Axiale resolutie onder 4 urn werd verworven met 100 urn pinhole en 60x objectief lens (LUMFLN, water onderdompeling, NA 1,1, Olympus). Beelden (512 × 512 pixels) werden verkregen met een beeldsnelheid van 30 Hz. Voor de signaal-ruisverhouding verbetering van het beeld, werden de ruis over 90 frames na het post-processen van de real-time beelden (30 frames / sec) gemiddeld door het verwijderen van de bewegingsartefact gegenereerd uit peristaltiek met een op maat geschreven MATLAB-programma. ImageJ software (NIH) werd gebruikt voor het meten van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in de lamina propria.

Lipide absorptie test

Na het verwijderen van voedsel gedurende 12 uur, werd 200 ul olijfolie (Sigma-Aldrich) toegediend door orale maagsonde voor plasma triglyceride meting en Oil Red O kleuring. Bloed werd bemonsterd via de staartader in de bloedafnamebuis met heparine op 0, 1, 2, 3, en 4 h na olijfolie toediening. De plasma-triglyceridenconcentratie werd gemeten met een VetTest Chemistry analyzer (IDEXX Lab). De dunne darm werd gekleurd met Oil Red O om 12 uur na de olijfoliegavage volgens het protocol van de fabrikant van de Oil Red O Staining Kit (MAK194, Sigma-Aldrich). Het voederen met een vetrijk dieet (HFD) (60% kcal vet, Research Diets, D12492) begon op 12-jarige leeftijd en werd 8 weken voortgezet voor plasma triglyceride meting en Oil Red O kleuring. Bloed werd afgenomen via de staartader in een bloedafnamebuis met heparine na 6 uur vasten. Voor Oil Red O kleuring van leversecties, lever geoogst, gefixeerd in 4% PFA overnacht bij 4 ° C, werden gesneden tot 100 pm vibratome secties (Leica, VT1200S), werden gekleurd met Oil Red O.

Transductie van AAV

Geïndiceerde muizen kregen een enkele i.p. dosis (1012 virusdeeltjes in 150-200 µl) van een recombinant AAV dat codeert voor de ligandbindende domeinen 1-4 van VEGFR3, versmolten met het IgG Fc-domein (AAV-mVEGFR31-4-Ig), en controlemuizen kregen dezelfde dosis AAV dat codeert voor de domeinen 4-7 van VEGFR3, die niet binden aan VEGF-C of VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), versmolten met het IgG Fc-domein, zoals eerder beschreven37. AAV-mVEGFR31-4-Ig en AAV-mVEGFR34-7-Ig werden gedetecteerd in serum door immunoblotting analyse (anti-VEGFR3 antilichaam; geiten polyklonaal, AF743, R&D) van 0.5 ul van serummonsters verzameld op dezelfde dag van de darmanalyse.

Behandeling met antilichaam

Voor VEGFR2-blokkade gebruikten we een VEGFR2-neutraliserend antilichaam (DC101). Een hybridoma cellijn die DC101 produceert werd aangekocht bij American Type Culture Collection (ATCC). Hybridoma cellen werden gekweekt in serumvrij medium. De recombinante eiwitten in het supernatants werden gezuiverd door kolomchromatografie met Protein A agarose gel (Oncogene). Na zuivering werden de recombinante eiwitten gekwantificeerd met de Bradford-test en bevestigd met Coomassie-blauwkleuring na natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). DC101 (50 mg / kg) of een gelijke hoeveelheid van het controle-antilichaam (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) werd i.p. geïnjecteerd in de aangegeven muizen om de 2 dagen gedurende 2 weken.

Intestinale LEC verrijking en IntSC isolatie van de dunne darm

De serosa, spierlaag, en mesenteriale vetweefsels werden verwijderd uit de dunne darm. Na het openen darmfragmenten longitudinaal en wassen met PBS, werden monsters gesneden in 2 cm stukken, en Peyer’s patches werden verwijderd. De monsters werden gewassen met PBS en geïncubeerd met 10 mM EDTA met calcium- en magnesiumvrije DMEM (Gibco) op ijs gedurende 20 min. De weefsels werden met calciumvrij PBS geveerd tot een helder supernatant werd verkregen dat vrij was van epitheelcellen. Monster stukken werden verder gesneden in 1 mm fragmenten en gedissocieerd met dissociatiebuffer die 2 mg / ml collagenase II (Worthington), 1 mg / ml Dispase (Gibco), en 1 U / ml DNase (Invitrogen) in DMEM bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Om dissociatie te helpen, werden stukjes weefsel voorzichtig op en neer gepipetteerd om de 10 min. De monsters werden vervolgens gefiltreerd door een 70 urn zeef mechanisch uit elkaar te halen de resterende darmfragmenten. Na het verzamelen van de supernatanten, werd een gelijk volume DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS) toegevoegd. Na centrifugatie werden de cellen geresuspendeerd in PBS. Voor het verrijken van de stromale cellen fractie en LECs, hematopoietische cellen en epitheliale cellen werden uitgewist met behulp van AutoMACS (Miltenyi) na incubatie gedurende 15 min op ijs met anti-CD45 en anti-CD326 Microbeads (Miltenyi). Voor IntSC isolatie, werden anti-CD31 Microbeads (Miltenyi) toegevoegd aan endotheelcellen uit te putten in aanvulling op de anti-CD45 en anti-CD326 Microbeads.

Primaire cultuur van muis IntSCs

Na de isolatie van IntSCs, werden cellen gekweekt met DMEM/F12 met 10% FBS op een weefselkweekplaat gedurende 24 uur of 2 dagen. Voor medicijnbehandelingen en immunofluorescentiekleuring werden 50.000 cellen per well uitgezet op 4-well Nunc Lab-Tek II kamerglaasjes (Sigma-Aldrich). Drug concentraties worden beschreven in de aangegeven figuur legenden en behandelingen duurde 6 uur voor immunofluorescentie en genexpressie analyse. Een 35-mm imaging schotel met een elastisch ondersteund oppervlak (Ibidi) werd gebruikt voor IntSC cultuur op zachte (1,5 kPa) en stijf (28 kPa) matrices gedurende 24 uur. Voor de inductie van cre activiteit in primaire gekweekte IntSCs afkomstig van WT of Yap / Tazi ∆FRC muizen, werden cellen behandeld met 5 µM van 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT) in 100% ethanol (EtOH) of 100% EtOH alleen voor 2 dagen als controle. Culture-expanded monolayer van IntSCs die werden gevalideerd als PDGFRβ + werden gebruikt voor experimenten.

Flowcytometrie en celsortering

Om PDGFRβ+ IntSCs of intestinale LECs te sorteren, gingen de verrijkte fracties op RBC lysis door suspensie in ACK lysisbuffer (Gibco) gedurende 5 min bij RT. Na het blokkeren van Fcγ-receptoren met muis anti-CD16/CD32 (553141, BD Bioscience), werden de cellen geïncubeerd gedurende 15 min met de aangegeven antilichamen in FACS-buffer (2% FBS in PBS). Na verschillende wasbeurten werden de cellen geanalyseerd met FACS Canto II (BD Biosciences) en de verkregen gegevens werden verder geëvalueerd met behulp van FlowJo software (Treestar). Celsortering werd uitgevoerd met FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Dode cellen werden uitgesloten met behulp van DAPI (Sigma-Aldrich) kleuring en cel doublets werden systematisch uitgesloten. De intensiteit van de fluorescentie wordt uitgedrukt in willekeurige eenheden op een logaritmische schaal, en de voorwaartse en zijwaartse verspreiding worden op een lineaire schaal weergegeven. De volgende antilichamen werden gebruikt voor flowcytometrie: FITC anti-muis CD45 (11-0451-85, rat monoklonaal, Biolegend); FITC anti-muis TER-119 (11-5921-85, rat monoklonaal, Biolegend); APC anti-muis CD31 (551262, rat monoklonaal, BD Bioscience); en PE/Cy7 anti-muis Podoplanin (127412, syrische hamster monoklonaal, Biolegend).

Bulk RNA-sequencing

Bulk RNA-sequencing van de geïsoleerde PDGFRβ + IntSCs werd uitgevoerd door het verkrijgen van de uitlijning bestand. Kort gezegd, werden gelezen in kaart gebracht met behulp van TopHat software tool. Het uitlijningsbestand werd gebruikt om transcripten te assembleren, hun abundanties te schatten, en differentiële expressie van genen of isovormen te detecteren met behulp van manchetknopen. De Ingenuity Pathway Analysis tool (QIAGEN) werd gebruikt om de gegevens verder te evalueren in de context van canonieke signalering en te bepalen of YAP/TAZ-geïnactiveerde genen specifiek gerelateerd waren aan de secretoire moleculen. De significantie van de canonieke signalering werd getest met de Benjamini-Hochberg procedure, die de P waarde aanpast om te corrigeren voor meervoudige vergelijkingen, en hun activering of remming werd bepaald met verwijzing naar activering z-scores. Cluster analyse en heatmaps werden gegenereerd met behulp van Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Voor GSEA, gen set collecties van de Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/) werden gebruikt.

MEFs en HDLECs

Muis embryonale fibroblasten (MEFs) werden geïsoleerd uit E12.5 embryo’s zoals eerder beschreven32. Kortom, hoofd, ledematen en hartweefsel werden verwijderd en monsters werden fijngehakt met een schaar en gedigesteerd met 0,1% trypsine/EDTA met DNase (1 U / ml, Invitrogen) bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Na de spijsvertering en verwijdering van onverteerde weefsels, werden de cellen kort gesponnen, uitgezet op een 10 cm schotel, en toegestaan om te groeien tot subconfluentie. MEF’s werden vervolgens gehandhaafd in DMEM/F12 met 10% FBS. Menselijke dermale lymfatische endotheelcellen (HDLECs) werden gekocht bij Lonza en gekweekt in endotheel groeimedium (EGM2-MV, Lonza). MEF’s en HDLEC’s werden gebruikt bij passage 2 of 3. Cellen werden geïncubeerd in een gehumidificeerde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C en bevestigd mycoplasma-negatief (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Spheroid-based sprouting assay

LEC sferoïden werden gegenereerd door het kweken van HDLECs bij doorgang 2 of 3 in kweekmedium met 0,25% methylcellulose en ’s nachts geïncubeerd als hangende druppels36. De sferoïden werden vervolgens verzameld en ingebed in 2 mg/ml collageen type I (Corning), behandeld met controle boviene serumalbumine (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) of ANGPT2 (5 μg/ml, intern gegenereerd) met of zonder VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) in Endothelial Cell Basal Medium (PromoCell) met 1% FBS gedurende 24 uur. Aan het einde van de incubatie werden de sferoïden gekleurd met cell tracker (Molecular Probes, 1,5 uM, 37 ° C, 30 min). De sferoïden werden vervolgens gefixeerd in 4% PFA gedurende 15 min bij RT en belicht met behulp van Cell observer (Carl Zeiss).

Quantitatieve RT-PCR

RNA werd geëxtraheerd met behulp van RNeasy Micro kit (Qiagen) of Trizol RNA extractie kit (Invitrogen). Een totaal van 1 µg geëxtraheerd RNA werd getranscribeerd in cDNA met behulp van GoScript Reverse Transcription Kit (Promega). Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met FastStart SYBR Green Master mix (Roche) en S1000 Thermocycler (Bio-Rad) met de aangegeven primers. De primers werden ontworpen met behulp van Primer-BLAST of overgenomen uit eerder gepubliceerde studies, die worden beschreven in de supplementaire tabel 1. Gapdh werd gebruikt als referentiegen en de resultaten werden gepresenteerd als relatieve expressies ten opzichte van de controle. De specificiteit van de primerreactie werd bevestigd door analyse van de smeltcurve. Relatieve genexpressie werd geanalyseerd door ΔΔCt methode met behulp van de CFX Manager software (Bio-Rad).

In vitro rek en osmotische experimenten

MEFs en primaire muis IntSCs werden uitgerekt met behulp van een mechanische cel stretching instrument (STREX) met een 4% van de lineaire rek bij 10 cycli / min, en osmotische stress werd toegepast met 0,4 M sorbitol gedurende 3 uur zoals eerder beschreven40,50. Cellen werden gehouden in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 ° C tijdens alle experimenten.

Ex vivo osmotische experimenten

Na het openen van de buikholte onder anesthesie, werd jejunum deel van de dunne darm gesneden in 2 cm stukken. Darmfragmenten werden in de lengte geopend en gewassen met PBS. Weefsels werden vervolgens gekweekt in DMEM/F12 met 5% FBS en osmotische stress werd onmiddellijk toegepast met 0,4 M sorbitol in het kweekmedium gedurende 3 uur. Weefsels werden bewaard in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 ° C tijdens alle experimenten.

Immunofluorescentiekleuring van MEF’s

MEF’s werden uitgezet op 8-well Nunc Lab-Tek II chamber slides (Sigma-Aldrich) en gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 15 min bij 4 ° C. Na verschillende keren wassen met PBS werden de monsters geblokkeerd met 5% geiten- (of ezels-) serum in 0,5% PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden geïncubeerd met de aangegeven primaire antilichamen bij 4 °C gedurende een nacht. Gebonden primaire antilichamen werden gedetecteerd door incubatie met secundaire antilichamen gedurende 90 min bij RT. De volgende primaire antilichamen werden gebruikt voor de celkleuring: anti-YAP (konijn monoklonaal, 14074, Cell signaling); anti-TAZ (konijn polyklonaal, HPA007415, Sigma-Aldrich); en Alexa Fluor 488-geconjugeerde anti-falloidine (A12379, Thermo Fisher) antilichamen. Alexa Fluor 594-geconjugeerde secundaire antilichamen werden aangekocht bij Jackson ImmunoResearch. Nuclei werden gekleurd met DAPI (Invitrogen) en dia’s werden gemonteerd en afgebeeld zoals hierboven beschreven.

ChIP-qPCR

MEFs werden gefixeerd met 1% PFA gedurende 10 min en gedoofd met glycine. De monsters werden gewassen met PBS en gelyseerd met lysisbuffer met 1% SDS. Het gefixeerde DNA in de cellysaten werd gesonificeerd met behulp van een focusultrasoonapparaat (Covaris). De cellysaten werden gecentrifugeerd, en alle behalve 5% (bewaard voor hele cellysaat input controle) van de resulterende supernatanten werden verdund met ChIP verdunningsbuffer met 0,5% Triton X-100. Verdunde monsters werden vervolgens overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met anti-TEAD4 antilichaam (muis monoklonaal, ab58310, Abcam). Vervolgens werden protein A/G Dynabeads (Thermo Fisher) toegevoegd en de monsters werden gedurende 2 uur bij 4 °C geïncubeerd. De korrels werden geïsoleerd met DynaMag-2 (Thermo Fisher), gewassen met reeksen ChIP-wasbuffers: laagzoutwasbuffer, hoogzoutwasbuffer, LiCl-wasbuffer, en TE-buffer. De monsters werden twee keer gedurende telkens 15 min bij 65 °C geëlueerd in 1% SDS. De korrels werden verwijderd en zowel het geëlueerde materiaal als de 5%-grondmonsters van het gehele cellysaat werden ’s nachts bij 65 °C omgekeerd gekruist. Na normalisatie van de pH werden de monsters gedurende 30 min. met RNase (3 μg/ml) bij 37 °C en gedurende 2 uur met proteïnase K (20 mg/ml) en glycogeen (20 mg/ml) bij 55 °C geïncubeerd. DNA werd geëlueerd met behulp van standaard procedures en ChIP-DNA werden geanalyseerd door qPCR vergeleken met input monsters met behulp van de primers vermeld in aanvullende tabel 2.

ELISA

Supernatant van primair gekweekte muis IntSCs werden geoogst na strekken, en supernatant werd gecentrifugeerd gedurende 15 min. De concentratie van VEGF-C in supernatant werd gemeten door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met muis VEGF-C-specifieke ELISA kit (CSB-E07361m, Cusabio).

Morphometric analyse

Morphometrische metingen werden uitgevoerd met behulp van ImageJ software (NIH), ZEN 2012 software (Carl Zeiss), of Imaris (Bitplane). Voor lactus oppervlakte kwantificering, werd een drempel ingesteld voor de beelden worden geanalyseerd en absolute villus LYVE-1 + oppervlakte werd gemeten voor elke lactus binnen de villus. Absolute melkblaasjes lengte, absolute villi lengte, en absolute villi breedte werden gemeten met behulp van beelden van villus E-cadherine + of CD31 + of LYVE-1 + immunokleuring in elke willekeurige 850 µm2 velden van het aangegeven deel van de darm. Voor lacteale en darmvlokken oppervlakte, lengte en breedte kwantificaties, werden ten minste 100 darmvlokken geanalyseerd langs de gehele dunne darm. Kwantificering voor de volgende parameters in de dunne darm werd uitgevoerd in jejunum. Aantal lacteal scheuten en aantal lacteal vertakkingen werden gemeten in 10-20 willekeurige LYVE-1 + lacteal. Aantal Prox1 + LECs en aantal Prox1 + EdU + LECs werden handmatig geteld binnen 100 pm lengte van 10-20 willekeurige LYVE-1 + Lacteal. Kwantificering van VE-cadherin + knooppunten van lacteal werd uitgevoerd met × 40 objectief lens in lacteals van 5-10 villi per muis. Kort samengevat, rits-type kruising werd gedefinieerd als continue knooppunten op cel-cel grenzen met cellen die langwerpige vorm51. Knoopvormige junctie werd gedefinieerd als discontinue juncties die niet parallel zijn met de cel-cel grenzen en de eikenblad-achtige celvorm. Knoopvormige knooppunten werden gedefinieerd als discontinue knooppunten die niet parallel lopen met de cel-celgrenzen en de eikenbladachtige celvorm. Knooppunten die niet overeenkomen met een van beide patronen werden gecategoriseerd als gemengd type. Fluorescentie-intensiteit (FI) van BODIPY en de kwantificering ervan werden uitgevoerd zoals eerder beschreven34. Olie rood O-gebied werd gemeten als Olie rood O + gebied gedeeld door villus gebied en genormaliseerd door het gemiddelde van die van controle muizen. Villus gladde spiercel dekking gebied werd gemeten als absolute αSMA + dekking gebied in vijf 850 µm2 velden per monster, die vervolgens werd genormaliseerd door het gemiddelde van die van de controle muizen. Om de relatieve expressies van lactale VEGFR3 te kwantificeren, werd de gemiddelde FI gemeten in vijf 425 µm2 velden per monsters en werd gepresenteerd als relatieve waarden gedeeld door de controle. Om de dichtheid van de bloedvaten te bepalen, werd de oppervlakte van VEGFR2 gemeten in vijf velden van 425 µm2 per monster en gepresenteerd als relatieve waarden ten opzichte van de controle. Het oppervlak van CD3+ T-cel of F4/80+ macrofaag werd gemeten in vijf velden van 425 µm2 per monster. Lymfevat dichtheid werd berekend door het meten van LYVE-1 + gebied in vijf willekeurige 425-850 µm2 velden van hele mount monsters en gepresenteerd als relatieve waarden ten opzichte van de controle.

Droplet-gebaseerde single-cel RNA sequencing

Gesorteerde enkele cellen werden verwerkt met behulp van de 10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) volgens de protocollen van de fabrikant. Kortom, gesorteerde cellen werden geresuspendeerd in PBS met 0,5% BSA en gemengd met RT-reagens mix en RT-primer, die vervolgens werden toegevoegd aan elk kanaal in 10X chips, gericht op 5000 cellen. Cellen werden gescheiden in Gel Beads in Emulsie waar RNA transcripten van enkele cellen werden gebarcodeerd en omgekeerd getranscribeerd. Na de opbouw en amplificatie van de cDNA-bibliotheek werden de cDNA-moleculen enzymatisch gefragmenteerd, aan het einde gerepareerd en van een A-staart voorzien. Na selectie van de juiste grootte van de verwerkte cDNA-moleculen door middel van dubbele grootte selectie met SPRI kralen (Beckman Coulter), werden ze geligeerd met een adaptor, en monster-index PCR werd uitgevoerd. Na een andere dubbele grootte selectie met SPRI kralen, werden de uiteindelijke bibliotheek constructies 10-voudig verdund en liep op de Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip voor kwaliteitscontrole. Single-cel bibliotheken werden vervolgens gesequenced met behulp van Illumina HiSeq-X platform.

Voorbewerking van single-cel RNA data

Raw sequencing gegevens werden eerst de-multiplexed en in kaart gebracht muis referentiegenoom (mm10) met behulp van Cell Ranger 3.0.2 toolkit van 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Met behulp van R-pakket Seurat (versie 3.0.0)52, ruwe expressie matrices werden gebouwd met behulp van Read10X functie. Cellen met minder dan 1000 gedetecteerde genen of meer dan 6000 gedetecteerde genen (beschouwd als potentiële doubletten) werden uitgesloten (Supplementary Fig. 17a). Bovendien werden cellen met een hoge mitochondriale gen geassocieerde unieke moleculaire identifier (UMI) telt (>7% van het totaal) beschouwd als dode cellen en dus uitgesloten. Genen die door minder dan 3 cellen tot expressie werden gebracht, werden verwijderd. Bovendien werden een klein aantal verontreinigende Ptprc + immuuncellen en Pecam1 + Cdh5 + endotheelcellen uitgesloten na de eerste ronde van clustering. Na het verwijderen van ongewenste cellen en genen, werden UMI tellingen voor elk gen voor een cel gedeeld door de totale expressie van een bepaalde cel en vermenigvuldigd met 10.000 en log-getransformeerd. Vervolgens werden genen geschaald en gecentreerd door variabelen zoals mitochondriaal gen percentage en aantal UMI’s uit te regresseren.

Identificatie van variabele genen en dimensionaliteitsreductie

R pakket Seurat werd gebruikt voor clustering analyse. Eerst werden de meest variabele genen in de dataset geïdentificeerd met de FindVariableFeatures functie in Seurat met optie: selection.method = “vst”. Top 2000 genen met de hoogste variabiliteit werden geselecteerd voor downstream analyse. Met behulp van de geïdentificeerde variabele genen, werden de eerste dimensies gereduceerd met behulp van principale componenten analyse (PCA). De functie JackStraw werd gebruikt om de statistische significantie van de PCA-scores te bepalen. De meest significante 30 principale componenten (PCs) werden gebruikt als input voor Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) om de gegevens te reduceren tot twee-dimensionale ruimte.

Cluster analyse

Om cellen te clusteren door hun transcriptionele profielen, voerden we een unsupervised clustering uit op de top 2000 zeer variabele genen voor alle vier monsters. We bouwden eerst gedeelde naaste buren (SNN) grafiek op de belangrijkste component ruimte door gebruik te maken FindNeighbors functie. Daarna pasten we het Louvain algoritme toe voor modulariteitsoptimalisatie-gebaseerde clustering met behulp van de FindClusters functie. De parameters voor de resolutie van de clustering werden ingesteld op het punt waar de clusters sterk verschillende transcriptionele profielen vertoonden. Clustering waren onafhankelijk van het aantal gedetecteerde genen per cel (Supplementary Fig. 17b). Clusterspecifieke markers waren differentieel tot expressie komende genen voor elke cluster geïdentificeerd via FindMarkers functie in Seurat met de volgende instellingen: min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15, test.use = “MAST”. Geïdentificeerde markers met aangepaste P < 0,05 werden gebruikt voor verdere analyse. Aangezien sommige celtypen zoals gladde spiercellen en mural cellen hadden bekende markers, hun verschijning aan de top van de marker lijst voor elk cluster gevalideerd onze marker selectie processen. Om ongewenste bron van variaties, zoals geslacht te verwijderen, werden cellen gesplitst door de aanwezigheid van vrouwelijke specifieke transcript Xist en geïntegreerd. Om de integratie van verschillende datasets uit te voeren, hebben we eerst log genormaliseerd elke ruwe expressie matrices en geïdentificeerd top 2000 zeer variabele genen voor elke dataset. Dan, met behulp van FindIntegrationAnchors functie in Seurat, identificeerden we ankers tussen datasets. Vervolgens werden de datasets geïntegreerd op basis van de geïdentificeerde ankers via de IntegrateData functie in Seurat. Geïntegreerde datasets werden vervolgens geschaald en dimensies werden gereduceerd voor verdere clusteranalyse. Clusters in de geïntegreerde datasets werden geannoteerd door hun expressie profielen van genen in de geïdentificeerde maker lijsten.

Gene ontologie verrijking analyse

Gene ontologie verrijking analyse op de cluster markers werden uitgevoerd met behulp van R-pakket goseq (versie 1.34.0)53. Afhankelijk van de lengte van het gen werden wegingen voor elk gen verkregen en werd de Wallenius-benadering gebruikt om geassocieerde gen-ontologietermen te identificeren. Gen ontologie termen met aangepaste P < 0.05 en biologische proces categorieën werden geselecteerd.

Statistieken

Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefgrootte vooraf te bepalen. De experimenten werden gerandomiseerd en de onderzoekers waren geblindeerd voor de toewijzing tijdens de experimenten en de uitkomstanalyses. Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking (SD). Statistische significantie werd bepaald door de tweezijdige Mann-Whitney U test tussen twee groepen of de twee-weg ANOVA met Holm-Sidak’s multiple vergelijkingen test voor multiple-groep vergelijking. Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.