1 Theorie
Oligonucleotiden worden gesynthetiseerd door de toevoeging van één base tegelijk, die zich uitstrekt van het 3′- tot het 5′-eind, vastgemaakt aan een drager in vaste fase. Wanneer de chemische synthese van het oligonucleotide voltooid is, wordt de DNA-keten losgemaakt van de vaste drager door incubatie met ammoniumhydroxide. Ammonium werkt ook als een deprotectief middel, waarbij de groepen die de fosfaten in de fosfodiesterbindingen beschermen, worden weggesplitst. Daarna wordt hete ammonia toegevoegd om de beschermende groepen van de exocyclische aminogroepen van desoxyadenosine, desoxycytosine en desoxyguanosine te hydrolyseren. Het oligonucleotide kan in de ammoniakoplossing als ruw preparaat aan de gebruiker worden geleverd. In dat geval kan het nodig zijn vóór gebruik een extra stap uit te voeren om de zouten en bijproducten die tijdens de deprotectie ontstaan, uit het oligonucleotidepreparaat te verwijderen.
Na deprotectie wordt het oligonucleotidepreparaat gewoonlijk ontzout, gekwantificeerd, in een vriesdroogapparaat tot droogheid ingedampt en in poedervorm aan de gebruiker geleverd. De ontzoute oligonucleotide-oplossing bevat het volledige oligonucleotide, maar ook een mengsel van afgeknotte producten die zich tijdens de chemische synthese hebben opgehoopt. Truncatie treedt op wanneer de gespecificeerde base er niet in slaagt in de overeenkomstige cyclus aan de keten toe te voegen (Hecker & Rill, 1998). Het percentage afgeknotte producten dat in het preparaat wordt geaccumuleerd, wordt dus bepaald door de synthese-efficiëntie (de fractie volwaardig product na synthese) en de lengte van het molecuul. Lange oligonucleotiden, die meer cycli nodig hebben om te worden gesynthetiseerd, zijn minder zuiver dan korte oligonucleotiden. Deze mislukkingen kunnen in sommige toepassingen concurreren met het product van de volle lengte en moeten wellicht worden verwijderd voordat het oligonucleotide kan worden gebruikt. Ontzoute oligonucleotidepreparaten zijn echter meestal geschikt voor veel toepassingen, zoals standaard PCR of microarrays, vooral als het oligonucleotide < 20 nucleotiden lang is.
Voor oligonucleotiden langer dan 50 basen wordt verdere zuivering aanbevolen omdat het percentage full-length product in het preparaat meestal niet hoger is dan 80%. Voor veeleisende toepassingen waarbij de exacte lengte van het oligonucleotide van belang is, zoals gel-shift assays, gerichte mutagenese, sequencing, productie van kloneringsadapters of first-strand cDNA-synthese voor het genereren van bibliotheken, wordt extra zuivering aanbevolen, zelfs voor kortere oligonucleotiden (zie meer informatie over de technieken hierboven op Standaard in vitro Assays voor Eiwit-Nucleïnezuur interacties – Gel shift Assays voor RNA- en DNA-binding en gerichte mutagenese).
Purificatie kan nodig zijn na synthese of na enzymatische modificatie van het oligonucleotide. Er zijn verschillende methoden om dit te bereiken, en de keuze hangt af van de aard van het oligonucleotide en de toepassing waarvoor het bestemd is.
Reverse phase HPLC purification is gebaseerd op hydrofobiciteit. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een apolaire stationaire fase en waterige buffers en organische oplosmiddelen als mobiele fase om de analyten te elueren; polaire verbindingen worden het eerst geëlueerd, terwijl apolaire verbindingen worden tegengehouden. Dit is de beste methode voor het zuiveren van oligonucleotiden die met een hydrofobe groep zijn gemodificeerd, zoals biotine, fluorescerende kleurstoflabels of NHS-esterconjugaties. De massa-terugwinning is hoger dan bij PAGE-zuivering en de methode is geschikt voor de zuivering van grotere hoeveelheden oligonucleotiden (op mmolenschaal), hoewel onvolledige producten niet zo effectief worden verwijderd. Oligonucleotide zuiveringspatronen, gebaseerd op omgekeerde-fase chromatografie, bieden een snelle methode voor het ontzouten en zuiveren van oligonucleotiden.
Polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) lost oligonucleotiden op naar gelang van hun lengte en biedt daardoor voldoende resolutie om full-length producten te onderscheiden van mislukte moleculen (Atkinson en Smith, 1984). Polyacrylamide-gels zijn doeltreffender voor het scheiden van kleine DNA-fragmenten dan agarose-gels (zie Analyse van RNA door analytische polyacrylamide-gelelektroforese en Agarose-gelelektroforese). Het enige nadeel van polyacrylamide-gels is dat zij moeilijker te bereiden en te hanteren zijn dan agarose-gels. Polyacrylamide-gelen worden in een verticale configuratie in een constant elektrisch veld uitgevoerd. Na de elektroforese wordt het oligonucleotide uit de gel geëlueerd en geconcentreerd met behulp van ethanol-precipitatie (meer informatie over precipitatie van nucleïnezuren is te vinden op RNA purification – precipitation methods) of omgekeerde-fase-chromatografie. Dit is de methode bij uitstek wanneer voor veeleisende toepassingen het hoogste percentage full-length oligonucleotiden gewenst is. Zij wordt ook sterk aanbevolen voor oligonucleotiden met een lengte van meer dan 30 basen. Bovendien kunnen meerdere monsters tegelijk worden uitgevoerd en is geen dure apparatuur nodig. Het enige nadeel van deze techniek is de geringe hoeveelheid oligonucleotide die per zuivering wordt verkregen. Gewoonlijk worden oligonucleotiden gebruikt op een schaal van 1 μmol of minder, en de massa-terugwinning na PAGE-opzuivering is < 50% en zelfs lager in het geval van gemodificeerde oligonucleotiden. Hoewel de opbrengst laag is, is deze toch bevredigend voor de meeste biochemische toepassingen.
Het oligonucleotidepreparaat wordt op een denaturerende polyacrylamidegel geladen in een hoeveelheid van ten minste 1 mg per rijstrook. Het resolutiebereik van de gel is afhankelijk van de polyacrylamideconcentratie. Voor korte oligonucleotiden (van 15 tot 35 basen) worden polyacrylamidegels van 13-15% aanbevolen; voor langere oligonucleotiden (van 35 tot 70 basen) worden polyacrylamidegels van 8-13% aanbevolen. Het percentage van de gel moet worden aangepast aan het gebruikte systeem. Wij gebruiken meestal het Bio-Rad Mini Protean II-systeem en laten 15%-gels lopen om oligonucleotiden van 25 basen lengte te zuiveren. Na identificatie van de juiste band door UV-visualisatie, wordt de band geëxcideerd en geëxtraheerd uit de gel.
Twee verschillende methoden voor het zuiveren van oligonucleotiden uit polyacrylamide gels worden beschreven in dit hoofdstuk. De eenvoudigste methode is elutie door middel van diffusie. Deze is gebaseerd op de beweging van moleculen van een gebied met een hogere concentratie naar een gebied met een lagere concentratie. Het resultaat van diffusie is een geleidelijke vermenging van het materiaal. Deze methode is tijdrovend, maar vereist niet al te veel arbeid of apparatuur. In principe wordt de polyacrylamideband die het oligonucleotide van belang bevat, in kleine stukjes gesneden en bedekt met elutiebuffer. Na incubatie wordt het DNA uit het supernatant gezuiverd door precipitatie met ethanol. De opbrengst is beperkt, tussen 20% en 70%, afhankelijk van de lengte van het oligonucleotide. Hoe groter de gebruikte hoeveelheid elutiebuffer, hoe meer oligonucleotide uit de gel diffundeert.
De tweede methode is elektro-elutie in een dialysezak (McDonell et al., 1977). Het stuk gel dat het oligonucleotide bevat, wordt uitgesneden en in een dialysezak met een buffer geplaatst. Door de toepassing van een elektrische stroom migreert het DNA uit de gel in de buffer van de dialysezak. Het oligonucleotide wordt uit deze buffer teruggewonnen en gezuiverd. Met deze methode kan het oligonucleotide met een goede opbrengst worden geïsoleerd, hoewel het tijdrovend is als een groot aantal monsters tegelijk wordt gezuiverd, omdat elke gelband in afzonderlijke dialysezakjes moet worden ingebracht. Deze methode werkt ook goed voor grotere DNA-fragmenten en kan zelfs worden gebruikt om DNA uit agarosegels te extraheren.