Main Text
Het menselijke Y-chromosoom wordt voor het grootste deel van zijn lengte direct van vader op zoon doorgegeven, waardoor een mannelijk-specifiek overervingspatroon ontstaat dat verschillend is van de rest van het genoom. Fenotypische kenmerken van het Y-chromosoom zouden dus gemakkelijk te herkennen moeten zijn aan hun mannelijke overerving, en vroege studies beweerden verschillende van zulke kenmerken te identificeren, waaronder opmerkelijke voorbeelden zoals “harige oren”. Maar al in 1957 werd bij kritisch onderzoek van deze beweringen voor geen van de 17 beschouwde kenmerken steun gevonden,1 een bevinding die door latere moleculair-genetische analyse van “harige oren” zelf werd versterkt.2 Dit misschien verrassende gebrek aan Y-chromosomale kenmerken kan tenminste gedeeltelijk worden begrepen als het gevolg van twee factoren. Ten eerste, toen in 2003 een referentiesequentie voor de mannenspecifieke regio van het menselijke Y-chromosoom werd gegenereerd,3 bleek dat het chromosoom weinig mannenspecifieke genen draagt en codeert voor slechts 23 verschillende eiwitten. Latere werkzaamheden hebben uitgewezen dat drie van deze genen ontbreken bij ongeveer 2% van de Zuid-Aziatische mannen, wier Y-chromosomen dus coderen voor slechts 20 mannenspecifieke eiwitten.4 Ten tweede heeft het Y-chromosoom gespecialiseerde functies in de mannelijke geslachtsbepaling en vruchtbaarheid, waarbij het onwaarschijnlijk is dat Mendeliaanse variatie erfelijk zou zijn. Daarom kon men begin 2004 schrijven “stamboomanalyse heeft nog geen enkel Y-gebonden gen aan het licht gebracht “5. Later dat jaar werd echter Y-gebonden slechthorendheid (DFNY1, MIM 400043) gemeld in een Chinese familie6 en dit blijft de enige gedocumenteerde Mendeliaanse aandoening die Y-gebonden is bij mensen. De basis ervan lijkt dus waarschijnlijk ongebruikelijk en is van groot belang. Hier onderzoeken we deze basis door de volgorde van het DFNY1 Y-chromosoom te onderzoeken en te vergelijken met het Y-chromosoom van een nauw verwante maar niet aangetaste tak van de familie.
In de zeven generaties DFNY1 stamboom gerapporteerd in 2004, waren alle volwassen mannen getroffen.6 Vervolgens werd de stamboom nog twee generaties terug getraceerd, en extra mannelijke lijn afstammelingen van een eerdere voorouder werden geïdentificeerd.7 Opvallend was dat hun gehoor niet aangetast was (figuur 1). We hadden eerder de identiteit van de Y-chromosomen van de twee takken van de familie aangetoond op 67 Y-STR loci, en we redeneerden daarom dat het fenotypische verschil tussen de takken geassocieerd moest zijn met een genetische variant die specifiek gedragen werd door het Y-chromosoom van de aangetaste tak. We sorteerden een representatief Y-chromosoom van elke tak met behulp van flowcytometrie en sequenceerden het vervolgens. Slechts vier basen-substitutie verschillen werden geïdentificeerd tussen de chromosomen.8 Drie van deze waren ontstaan op de niet-aangetaste tak. De vierde was ontstaan op de aangetaste tak en segregeerde met het fenotype, maar het was een slechte kandidaat voor de causale mutatie omdat het buiten een geannoteerd gen lag. Hoewel deze analyse de herhaalde regio’s van het chromosoom niet kon evalueren, zijn de bekende herhaalde genen voornamelijk betrokken bij de spermatogenese,3,9 zodat we in de huidige studie de mogelijkheid hebben onderzocht dat de causale mutatie misschien geen puntmutatie is. Deze studie werd goedgekeurd door de monsterdonoren, die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven, en door het Comité voor Medische Ethiek van het Chinese PLA General Hospital, Beijing, China.
De DFNY1-stamboom
Mannetjes, vierkantjes; vrouwtjes, cirkels; diagonale lijn, overleden. Gevulde symbolen wijzen op slechthorendheid (ook uit familiebestanden); vraagtekens geven twee individuen aan van wie het gehoorfenotype onbekend is; en sterretjes geven individuen aan die op de getroffen tak staan, maar die op het moment van het onderzoek jonger waren dan de leeftijd waarop de symptomen begonnen. Pijlen geven de twee individuen aan van wie de Y-chromosomen werden gesequenced. De structurele herschikking vond plaats tijdens een van de vier meiose, gemarkeerd met rode sterren. Echtgenoten zijn weggelaten in de generaties VII-IX en in generatie VI op de niet-getroffen tak.
We onderzochten de relatieve leesdiepte langs het chromosoom door uitlijning van hoge kwaliteit dubbel-gefilterde leest aan de chrY referentievolgorde met behulp van Sequence Search and Alignment by Hashing Algorithm 2 (SSAHA2) 10 en het vergelijken van de aantallen leest per 10 kb bin tussen Y-chromosomen van het getroffen individu VIII-2 (figuur 1) en de niet-aangetaste individu VII-24 (figuur 1). Dit onthulde drie discontinue segmenten gedupliceerd in het aangetaste chromosoom, en alle waren afgeleid van de beperkte regio tussen de TSPY1 (MIM 480100) gen cluster eindigend op ∼9.3 Mb en de centromerische kloof op ∼10.1 Mb (figuur 2A). Deze duplicaties werden bevestigd door conventionele oligonucleotide array comparative genomic hybridization (CGH) met een Agilent 1 miljoen array die het hele genoom bestrijkt en een aangepaste NimbleGen 385K array die posities chrY: 2.000.000-10.715.000 (1.990.000-10.105.000 hg19) bij hoge (∼20 bp) resolutie omspant (Figuur 2B). Omdat ze een deel van de TSPY1-gencluster omvatten, controleerden we een toename van het aantal TSPY1-genen door qPCR (Tabel S1 in de Supplemental Data online beschikbaar) en pulsed-field gelelektroforese (PFGE; figuur S1). Deze analyses toonden aan dat de duplicatie gedeeld werd door alle aangetaste familieleden en afwezig was bij alle niet-aangetaste leden en ook dat de duplicatie in een apart restrictie fragment lag van de originele TSPY1 cluster en dus niet contigue was. Hoewel het gecombineerde bewijsmateriaal een complexe duplicatie van de 9.3-10.1 Mb regio bevestigde, gaf het geen informatie over waar de gedupliceerde sequenties werden ingevoegd. Metafase fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met een TSPY1 probe toonde een enkel signaal (niet getoond), dus gebruikten we fiber-FISH zoals eerder beschreven11 voor hogere resolutie. Y-chromosomale probes waren BAC-klonen die het grootste deel van ∼9.3-10.1 Mb van de referentiesequentie omspannen: RP11-334D2 (inclusief TSPY1), RP11-182H20, RP11-155J5, RP11-160K17, en RP11-108I14 (inclusief centromerische sequenties). De resultaten (figuur 2C) toonden aan dat de niet-aangetaste chromosoom werd georganiseerd op dezelfde manier als de referentie-sequentie, die kan worden samengevat als TSPY1-182H20-centromeer. In tegenstelling, werd het aangetaste chromosoom (Figuur 2D) onderbroken binnen de 182H20-sequentie om de organisatie TSPY1-partial 182H20-gap-centromeric duplicatie-TSPY1 duplicatie-182H20-centromeer te produceren. De fiber-FISH resultaten toonden dus aan dat de gedupliceerde Y-sequenties plaatselijk in een herschikte vorm werden teruggeplaatst, maar ze onthulden ook de aanwezigheid van een segment dat aan geen enkele probe uit het TSPY1-centromeergebied hybridiseerde.
Karakterisering van de structurele herschikking gedragen door het DFNY1 Y-chromosoom
(A) Relatieve leesdiepte (aangetast/onaangetast) in 10 kb bins in kaart gebracht op de Y-chromosoom referentiesequentie tussen 9,3 en 10,1 Mb. Let op de montage gaten aan elk uiteinde van deze regio.
(B) CGH log2 verhouding (getroffen / niet getroffen) voor dezelfde regio.
(C) Fiber-FISH van de drie BAC klonen aangegeven aan de niet-aangetaste Y-chromosoom, waaruit blijkt dat het de referentie-structuur in deze regio draagt. Zowel 334D2 als 108I14 detecteren tandem-arrays die groter zijn dan de grootte van de BAC-kloon.
(D) Fiber-FISH van dezelfde BAC-klonen op het aangetaste Y-chromosoom. Dit chromosoom draagt een insertie die de 182H20-hybridiserende regio onderbreekt en bevat gedeeltelijke duplicaties van zowel 334D2- en 108I14-hybridiserende sequenties.
(E) Absolute leesdiepte van niet-aangetaste en aangetaste Y-chromosoom leest naar de 160.15-160,35 Mb regio van de chromosoom 1 referentiesequentie.
(F) CGH log2 ratio (aangetast/onaangetast) voor dezelfde chromosoom 1 regio.
(G) Metafase FISH van de chromosoom 1 BAC kloon 179G5 op het onaangetaste Y-chromosoom (geel). Hybridisatie is alleen te zien op de referentielocatie op chromosoom 1.
(H) Metafase FISH van dezelfde chromosoom 1-sonde op het aangetaste Y-chromosoom (geel). Hybridisatie wordt gezien op een extra locus op het Y-chromosoom.
(I) Fiber-FISH van de twee aangegeven Y BAC-klonen plus de chromosoom 1-klonen 574F21, 179G5 en 1365F20 op het niet-aangetaste Y-chromosoom. Er wordt geen chromosoom-1-signaal op het Y-chromosoom gedetecteerd.
(J) Fiber-FISH van dezelfde klonen op het niet-aangedane Y-chromosoom. De chromosoom-1-klonen detecteren een signaal op het Y tussen het gedeeltelijke 182H20-signaal en het 108I14-signaal. De genoomcoördinaten verwijzen naar GRCh37/hg19.
Om deze onbekende sequenties te identificeren, hebben we thermische asymmetrische interlaced PCR (TAIL-PCR)12 uitgevoerd op het segment dat zich uitstrekt van het 182H20 breekpunt in de kloof, met behulp van de primers die in Tabel S2 staan. In opeenvolgende amplificaties paart deze procedure geneste primers die specifiek zijn voor de bekende sequentie met ontaarde primers waarvan verwacht wordt dat ze in de onbekende flankerende sequentie prikken. Kandidaat-knoopproducten worden herkend omdat hun grootteverschillen in opeenvolgende reacties de bekende primerposities weerspiegelen. De aangrenzende sequenties, bevestigd met breekpunt-specifieke primers (tabel S3 en figuren S2 en S3), waren afkomstig van chromosoom 1 (160,16 Mb), en onderzoek van de leesdiepte, CGH profielen (figuren 2E en 2F), en volgorde suggereerde de betrokkenheid van een aaneengesloten gebied van ∼160 kb, een dergelijke betrokkenheid werd ondersteund door de identificatie van een tweede meer complexe chromosoom 1-Y knooppunt op 160,32 Mb. De translocatie van chromosoom 1 sequenties naar de aangetaste Y werd bevestigd door metafase FISH (figuren 2G en 2H), en hun locatie binnen de kloof in de Y duplicatie werd bevestigd door fiber-FISH (figuren 2I en 2J) met BACs RP11-574F21, RP11-179G5, en W12-1365F20 van chromosoom 1 als probes. De gecombineerde gegevens onthulden dus een complexe duplicatiestructuur bestaande uit zowel een chromosoom 1 fragment als meerdere segmenten van Y DNA (Tabel S4 en Figuren S2 en S3). Geen van de gesequenceerde breekpunten vertoonde uitgebreide lengtes van homologie, maar alle onthulden microhomologie, een patroon dat duidt op FoSTeS (fork stalling and template switching), dat is een mechanisme dat ongelijksoortige genomische fragmenten combineert tijdens replicatie.13
De verdubbelde structuur hier waargenomen is niet elders gemeld en moet zijn ontstaan tijdens een van slechts vier meiose, die de meiose omvat waarin de DFNY1 mutatie zelf optrad (figuur 1). Het is daarom waarschijnlijk dat het een causaal verband is. De verdubbelde Y-chromosomale sequenties coderen voor slechts één bekend eiwit, TSPY1, uit een tandemreeks van ∼10 TSPY1 genen, terwijl de chromosoom 1 sequenties vijf RefSeq genen dragen (CASQ1, PEA15, DCAF8, PEX19, en COPA ) en het 5′ einde van een ander gen, NCSTN (MIM 605254) (exonen 1-3; Figuur 3). Mechanismen waardoor de duplicatie tot het doofheidsfenotype zou kunnen leiden zijn onder andere een toename in genkopie-aantal, onaangepaste expressie als gevolg van nieuw flankerend DNA, of vorming van een veranderd product door truncatie, fusie, of puntmutatie. Er zijn geen expressiegegevens beschikbaar van de DFNY1 familie, en er werden geen nonsynonieme mutaties gevonden in de chromosoom 1 RefSeq genen (Tabel S5). Het kopiegetal van TSPY1 is polymorf binnen de bevolking,14 en grotere aantallen kopieën van TSPY1 zijn gevonden zonder gerapporteerde doofheid, inclusief in 47,XYY individuen; één studie associeerde een hoog kopiegetal van TSPY1 met een ander fenotype, onvruchtbaarheid.15 Een verhoogd kopiegetal van TSPY1 is dus een slechte kandidaat voor doofheid. Daarentegen ligt de chromosoom 1 regio geheel binnen een interval van ongeveer 900 kb, DFNA49 (MIM %608372), dat eerder in verband werd gebracht met gehoorverlies; de causale mutatie in dit interval blijft onbekend.16 Wij stellen daarom voor dat hetzelfde gen of dezelfde genen ten grondslag zouden kunnen liggen aan zowel het DFNA49 als het DFNY1 fenotype. Het meest voor de hand liggende mechanisme zou dosis-gevoeligheid van één of meer van deze genen zijn, zodat verhoogde expressie als gevolg van drie kopieën tot gehoorverlies leidt, hoewel andere mechanismen niet uitgesloten zijn.
Structuur en geninhoud van de niet-aangetaste en aangetaste Y-chromosomen
(A) De structuur van het niet-aangetaste (VII-24 in figuur 1) Y-chromosoom. Grijs en zwart: fouten en lacunes, respectievelijk, in de GRCH37 assemblage. Blauw: regio die overeenkomt met de referentiesequentie op het gebruikte resolutieniveau. Hieronder weergegeven zijn een deel van de TSPY1 array (blauwe pijlpunten) en de locatie van BAC kloon signalen geïdentificeerd in figuur 2.
(B) Structuur van de getroffen (VIII-2 in figuur 1) Y-chromosoom. Dit chromosoom bevat een segment dat niet in de niet-aangetaste chromosoom, dit segment is afgeleid van duplicaties van sequenties van zowel chromosoom 1 (geel) en het Y-chromosoom (blauw). Nogmaals, de gen inhoud en BAC signalen worden hieronder getoond. De pijlpunten boven geven de oriëntatie van de gedupliceerde segmenten ten opzichte van de referentiesequentie.
(C) Gedetailleerde weergave van de twee chromosoom 1-Y knooppunten bestudeerd op de sequentie-niveau (figuren S2 en S3), met het verschil tussen de eenvoudige structuur van knooppunt 1 en de complexe structuur van knooppunt 2.
Wij vonden dat de oorzaak van de menselijke Y-gekoppelde Mendeliaanse stoornis geassocieerd was met insertie van chromosoom 1 sequenties in plaats van mutatie van een Y-chromosomaal gen. Dit is consistent met de waarnemingen dat noch duplicatie (47,XYY karyotype) noch deletie (45,X karyotype) van het gehele Y-chromosoom en dus van alle bijbehorende genen geassocieerd is met slechthorendheid, wat impliceert dat functieverlies of duplicatie van een Y-chromosomaal gen waarschijnlijk niet ten grondslag ligt aan het DFNY1 fenotype. De complexiteit van de herschikking is ook in overeenstemming met de zeldzaamheid ervan: Hoewel mannelijke doofheid een gemakkelijk herkenbaar fenotype zou moeten zijn, is er voor zover wij weten slechts één andere familie met een vergelijkbaar fenotype gerapporteerd.17 De relatie tussen de twee families is onbekend; de tweede familie is ook Chinees, maar van een andere etnische groep (Tujia in plaats van Han). De audiologische kenmerken zijn echter vergelijkbaar, en op basis van de huidige kennis is het onmogelijk om een gemeenschappelijke oorsprong uit te sluiten. Ondanks de zeldzaamheid van deze specifieke herschikking, beschouwen wij de overname van autosomale sequenties door het Y-chromosoom toch als een standaard onderdeel van de Y-chromosomale evolutie, die meestal neutraal is en soms fixatie bereikt, hoewel het in het geval van DFNY1 nadelig is. Het is inderdaad opmerkelijk dat het Y-chromosoom een vaste insertie van ∼100 kb van chromosoomregio 1q43 in proximale Yq draagt,18 dicht bij de DFNY1 insertie. Deze observatie roept de vraag op of de nabijheid in de kern de DNA-overdracht tussen deze twee chromosomen zou kunnen bevorderen.19 Het voorgestelde DFNY1-mutatiemechanisme, FoSTeS, is eerder alleen in verband gebracht met intrachromosomale herschikkingen,13 dus de huidige studie breidt de invloed ervan uit tot interchromosomale herschikkingen; het onderstreept ook de noodzaak van een beter begrip van de verwaarloosde relatie tussen kopie-aantalvariatie en slechthorendheid.20