U.S. Food and Drug Administration

ITG SUBJECT: PYROGEN, EEN GEVAAR

Inleiding

Met de komst van de injectienaald kwam er een nieuwe manier om geneesmiddelen toe te dienen. \Maar naar huidige maatstaven waren de eerste parenterale medicijnen ruw en onveilig, omdat het toegenomen gebruik van deze vroege injectievloeistoffen infecties, bijwerkingen van medicijnen, koortsen van onbekende etiologie en zelfs sterfgevallen door shock veroorzaakte. Het was verbijsterend voor de eerste medewerkers op het gebied van de microbiologie dat sporadische koortsen het gevolg waren van de injectie van zelfs de steriele oplossingen.

De moderne injectie-oplossingen zijn veiliger, maar de literatuur blijft melding maken van bijwerkingen. In dit nummer delen wij de bezorgdheid voor de patiënt die geen vloeistoffen via de mond kan innemen, als gevolg van een operatie of bepaalde soorten ziekte, en die de gevolgen zou kunnen ondervinden van ongewenste toxinen waarvan bekend is dat zij koortsverwekkende stoffen zijn, indien aanwezig in het parenterale produkt. Wij hopen profijt te trekken van wat op dit gebied is geleerd.

Historisch – Pyrogenen

In het laatste deel van de 19e eeuw was bekend dat sommige parenterale oplossingen een duidelijke stijging van de lichaamstemperatuur veroorzaakten. De koortsverwekkers waren niet bekend. Kwalen als gevolg van deze “koortsstof” werden onder andere omschreven als “injectiekoorts”, “gedistilleerdwaterkoorts” en “zoutwaterkoorts”. Tegenwoordig worden bacteriële pyrogenen erkend als het veroorzakend agens dat verantwoordelijk is voor veel van die vroege koortsen en voor veel van de andere biologische effecten die beschreven worden als gevolg van parenterale therapie. Hieruit kunnen we begrijpen waarom bij de bereiding en het gebruik van injectie-oplossingen de grootste zorg moet worden besteed aan het uitsluiten van het heimelijke pyrogeen.

Natuurlijke afweer en pyrogenen

Als gezonde mensen, onderworpen aan een universele verdeling van microben in het milieu, leven wij samen met de microbiële wereld. Gewoonlijk beperkt de natuurlijke afweer van het lichaam de microben en hun metabolieten (toxinen, enz.) tot gebieden waar zij kunnen worden getolereerd, zoals op de huid en in het spijsverteringskanaal. Via de parenterale toedieningsweg van een geneesmiddel kan een eventueel aanwezig pyrogeen de normale afweer van het lichaam omzeilen. De reactie van de gastheer wordt bemiddeld via de leukocyten (witte bloedlichaampjes) die op hun beurt hun eigen soort pyrogeen (endogeen pyrogeen) vrijgeven en dit brengt op zijn beurt de koortsreactie en een veelheid van andere biologische reacties op gang.

Biologische effecten van endotoxinen

De grote verscheidenheid aan biologische effecten die worden toegeschreven aan bacteriële pyrogenen heeft veel belangstelling gewekt. \De reacties van de gastheer op pyrogenen zullen naar verwachting in de volgende categorieën vallen: 1) koortsopwekking, 2) shock, en 3) veranderingen in fysiologische functies.

Koorts is een bekend effect, vandaar de term “pyrogeen”. Ongeveer een uur na de injectie van pyrogenen in konijnen (of mensen), is er een stijging van de lichaamstemperatuur. Wanneer bacteriële pyrogenen in voldoende hoeveelheden, misschien microgrammen, worden ingespoten, gaat de koorts gepaard met koude rillingen, lichaamspijn, een stijging van de bloeddruk, en mogelijk een shocktoestand en de dood. Bij kleinere injectiehoeveelheden vertoont het lichaam een verhoogde capillaire permeabiliteit en een hele reeks andere veranderingen in de bloedsomloop. Voorbeelden van deze veranderingen zijn een vermindering gevolgd door een toename van het aantal witte bloedcellen, tumorbloedingen en veranderingen in de veneuze druk.

In bijzondere gevallen kan bij pyrogenen het verschijnsel van Shwartzman optreden. Dit is een ernstige hemorragische reactie met gelokaliseerde necrose. Het kan worden aangetoond bij een konijn dat eerst subcutaan met een bacterieel pyrogeen wordt geïnjecteerd, en 24 uur later wordt het konijn intraveneus met hetzelfde pyrogeen geïnjecteerd. De plaats van de latere injectie wordt in het centrum blauw en in de periferie rood.

Pyrogeentolerantie is een andere belangrijke reactie die zich ontwikkelt wanneer de dieren herhaalde injecties met een pyrogeen krijgen. Er ontstaat een verminderde gevoeligheid voor hetzelfde en andere pyrogenen, waardoor de koortsreactie teniet wordt gedaan en het tolerante dier van verdere pyrogeenproeven moet worden afgevoerd. “Gevoeligheid” betekent dat het dier reageert op een minimale hoeveelheid pyrogeen materiaal. Hoewel het konijn het meest gebruikte proefdier is, wordt de mens beschouwd als het meest gevoelig voor pyrogenen.

Bacteriële toxinen

Er zijn twee algemene soorten bacteriële toxinen. \Exotoxinen worden geproduceerd tijdens de groeifase van bepaalde soorten bacteriën en komen vrij in het medium of weefsel. Exotoxinen zijn eiwitachtig en hun reacties zijn specifiek. Zo produceert Clostridium botulinum een exotoxine met een ongewoon sterke werking dat alleen neurologisch weefsel aantast. Andere bekende voorbeelden van exotoxinen zijn tetanustoxine, Shiga-toxine en difterietoxine.

Endotoxinen zijn een ander soort toxine dat uit een grote verscheidenheid van gramnegatieve bacteriën kan worden geëxtraheerd. De term “endotoxine” is gewoonlijk uitwisselbaar met de term “pyrogeen”, hoewel niet alle pyrogenen endotoxinen zijn en pyrogeentests alleen niet volledig kunnen worden gebruikt voor de detectie en karakterisering van microbiële endotoxinen. Er zijn hogere doses endotoxine nodig om een dodelijk effect bij het proefdier te veroorzaken dan voor exotoxinen nodig zijn. De effecten van endotoxinen op de gastheer zijn systemisch, zoals koorts en algemene lichaamsreacties, en niet strikt neurologisch, zoals het geval is bij de meeste exotoxinen. Endotoxinen worden vooral aangetroffen bij gramnegatieve bacteriën en worden verkregen na de dood en autolyse van de cellen. De endotoxinen worden geëxtraheerd uit en geassocieerd met de celstructuur (celwand). Goede voorbeelden van pyrogeen producerende bacteriën zijn S. typhosa, E. coli, en Ps. aeruginosa.

Aanvullende eigenschappen van pyrogenen

In een opsomming van aanvullende eigenschappen, kan worden gezegd dat pyrogenen: (1) waarvan bekend is dat ze biochemisch bestaan uit een lipide-polysaccharide-peptide substantie; (2) hittestabiel zijn bij de temperatuur van kokend water; (3) een betrekkelijk lage acute toxiciteit hebben voor de mens; (4) een lage orde van immuunreactie vertonen; en (5) geproduceerd kunnen worden uit persisterende gramnegatieve bacteriën die een sterftecijfer van 50% zouden kunnen hebben.

De artsen wordt opgedragen onmiddellijk naar de oorzaak van persisterende bacteriëmieën te zoeken. Mogelijke oorzaken zijn phelbitis op de plaats van de katheter, infusie-apparatuur of de parenterale oplossing. Het is interessant op te merken dat de behandeling van patiënten in pyrogeenshock de toediening van parenterale vloeistoffen (hopelijk niet pyrogeen) omvat.

Make It Pyrogen Free

Bacteriedodende procedures zoals verhitting, filtratie of adsorptietechnieken elimineren pyrogenen niet uit parenterale oplossingen. Alle ingrediënten moeten in de eerste plaats pyrogeenvrij worden gehouden. Om dit te garanderen voert de fabrikant uitgebreide pyrogeenscreeningstests uit op alle parenterale geneesmiddeleningrediënten en zorgt hij voor de juiste opslag ervan vóór gebruik. Idealiter herkent de fabrikant de kritieke stappen in het productieproces die groei van pyrogeenproducerende bacteriën mogelijk kunnen maken, en hij controleert deze gebieden routinematig. Zo wordt bijvoorbeeld het water in de opslagtanks getest op pyrogenen en dringt de fabrikant aan op minimale opslagtijden zodat alleen pyrogeenvrij water wordt gebruikt. Pyrogeenvrij water, als “water voor injectie” omschreven in de USP, is het hart van de parenterale industrie.

Pyrogen Assay – USP

De huidige USP geeft een duidelijk overzicht van de pyrogeenbepaling. USP XIX beschouwt een oplossing als pyrogeen wanneer 10 m1/kg bij een konijn wordt ingespoten en er een temperatuurstijging is van 0,6 C of meer bij een willekeurig konijn, of een totale stijging van meer dan 1,4 C bij drie konijnen in een testgroep van drie konijnen. De officiële konijnenmethode vergt veel tijd, geld, opleiding en ervaring om onder de knie te krijgen. Er zijn weinig sluiproutes. Het gevolg van het niet testen op pyrogenen kan nog kostbaarder zijn in termen van reacties van patiënten en het terugroepen van geneesmiddelen.

Pyrogeen Assay – Limulus Amoebocyte Lysate

Veel laboratoria voeren pyrogeen assays uit met behulp van de limulus amoebocyte lysate (LAL) test methode. \De LAL-methode is vooral nuttig voor het screenen van producten die praktisch niet met de konijnenmethode te testen zijn. Producten die het best op endotoxinen kunnen worden getest met LAL-technieken zijn: radiofarmaceutica, anesthetica en veel biologische stoffen. Bij de LAL-methode reageert hemolymfe (bloed) van een degenkrab (limulus polyphemus) met een endotoxine tot een gel. De hoeveelheid endotoxine die gelvormt, wordt bepaald met verdunningstechnieken waarbij de gelvorming van een testmonster wordt vergeleken met die van een referentiepyrogeen, of met spectrofotometrische methoden waarbij de opaciteit van de gelvorming van een testmonster wordt vergeleken met die van een referentiepyrogeen. De LAL-test wordt beschouwd als specifiek voor de aanwezigheid van endotoxinen en is ten minste honderd maal gevoeliger dan de konijnentest. \Zelfs picogrammen endotoxinen kunnen met de LAL-methode worden aangetoond. Hoewel de LAL-methode een betrekkelijk nieuwe pyrogeentestmethode is, is er een grote verscheidenheid van polysaccharidederivaten aangetoond die positieve limulus-testresultaten geven en ook koortsactiviteit vertonen. Het is ook een feit dat sommige stoffen de LAL-test storen, zelfs als er pyrogenen aanwezig zijn.

Sommige bedrijven gebruiken de LAL-test voor het screenen van pyrogenen in grondstoffen, en vervolgen met pyrogeentests op het eindproduct door middel van de USP konijnentest. Voor de LAL-test op pyrogenen in geneesmiddelen is een wijziging van de NDA op individuele productbasis vereist. Voor LAL-testreagentia wordt een vergunning verleend door het Bureau voor biologische geneesmiddelen. Voor hulpmiddelen moet een bedrijf zijn protocol laten goedkeuren door de directeur van het Bureau of Medical Devices, voordat het de LAL-test kan vervangen door de konijnentest. \De toekomst van de LAL-test lijkt veelbelovend, omdat overwogen wordt deze methode in de USP op te nemen, maar het is op dit moment nog geen officiële methode.

Wat wel zeker is, is dat pyrogenen een potentiële bron van gevaar blijven bij het gebruik van parenterale therapie. Om pyrogenen volledig uit te sluiten, moeten we voortdurend toezicht houden op de productie van parenterale geneesmiddelen. \Niet via het spijsverteringskanaal maar langs een andere weg, zoals subcutaan, intramusculair, intraveneus, intraspinaal, enz.

Pyrogeen – een koortsverwekkende stof van bacteriële oorsprong; endotoxine. Dorland’s Illustrated Medical Dictionary. 25e E.W.B. Saunders, Philadelphia.

1. Singer, Charles Joseph; Underwood, Edgar Ashworth. Een korte geschiedenis van de geneeskunde. 2e Ed., 1962. Oxford Univ. Press, NY, and Oxford.
2. Hindman, S. H. et al. “Pyrogenic Reactions During Haemodialyzing Caused by Endotoxin.” Lancet 2 (7938): 732-4, 18 okt. 1975.
3. Kadis, Solomon; Weinbaum, George; Ajl, Samuel J.; Microbial Toxins Vol. IV & V. 1971 Academic Press, NY & London.
4. Davis, Bernard E., et al. Endotoxins: Textbook of Microbiology, pp 615-7. Vierde druk. Hoeber Medical Division. Harper & Row Publishers, NY.
5. Stainer, Roger Y.; Doudoroff, Michael; Adelberg, Edward A. The Microbial World, Prentice Hall, Inc., 3rd Ed, 1970.
6. Krupp, Marcus A. & Chatton, Milton J.; Current Medical Diagnosis and Treatment. p. 775, Lange Medical Publications, 1975, Los Altos, CA
7. Rastogi, S. C.; Hochstein, H. D.; Seligman, E. B. Jr.; “Statistical Determination of Endotoxin Content in Influenza Virus Vaccine by the Limulus Amoebocyte Lysate Test.” J. Clin Microbiol 6(2): 144-8, Aug. 1977.
8. Nandan, R.; Nakashima, C. Y., Brown, D. R.; “Detection of Endotoxins in Human Blood and Plasma.” Een verbeterde in-vitro pyrogeen test. Clin Chem 23(11): 2080-4 nov. 1977.
9. Wachtel, R. E.; Tskji, K.; “Comparison of Limulus Amoebocyte Lysates and Correlation with the USP Pyrogen Test.” Appl. Environ. Microbiology 33(6) 1265-9, June 1977.
10. Docket No. 77N-0282 zoals gevonden in FR Doc. 77-31926 Dossier 11-3-77 (Vol. 42, No. 213 — Vrijdag, 4 November 1977) en zoals gevonden in FR Doc. 78-623 Gedeponeerd 1-12-78 (Vol. 43, No. 9 — Vrijdag, 3 januari 1978)