1 Theorie
Oligonukleotide werden durch die Addition einer Base nach der anderen synthetisiert, die sich vom 3′- zum 5′-Ende erstreckt und an einen Festphasenträger gebunden ist. Wenn die chemische Synthese des Oligonukleotids abgeschlossen ist, wird die DNA-Kette durch Inkubation mit Ammoniumhydroxid vom festen Träger gelöst. Ammonium wirkt auch als Entschützer und spaltet die Schutzgruppen der Phosphate in den Phosphodiesterbindungen ab. Anschließend wird heißes Ammoniak zugegeben, um die Schutzgruppen von den exozyklischen Aminogruppen von Desoxyadenosin, Desoxycytosin und Desoxyguanosin zu hydrolysieren. Das Oligonukleotid könnte dem Anwender in der Ammoniaklösung als Rohpräparat geliefert werden. In diesem Fall kann vor der Verwendung ein zusätzlicher Schritt erforderlich sein, um die bei der Entschützung entstandenen Salze und Nebenprodukte aus dem Oligonukleotidpräparat zu entfernen.
Nach der Entschützung wird das Oligonukleotidpräparat in der Regel entsalzt, quantifiziert, in einem Gefriertrockner zur Trockne eingedampft und in Form eines Pulvers an den Anwender geliefert. Die entsalzte Oligonukleotidlösung enthält das Oligonukleotid in voller Länge, aber auch eine Mischung aus verkürzten Produkten, die während der chemischen Synthese angefallen sind. Eine Verkürzung tritt auf, wenn die angegebene Base im entsprechenden Zyklus nicht an die Kette angefügt wird (Hecker & Rill, 1998). Der prozentuale Anteil an verkürzten Produkten, der sich im Präparat ansammelt, wird also durch die Syntheseeffizienz (den Anteil des Produkts in voller Länge nach der Synthese) und die Länge des Moleküls bestimmt. Lange Oligonukleotide, die mehr Synthesezyklen benötigen, sind weniger rein als kurze Oligonukleotide. Diese Fehler können bei einigen Anwendungen mit dem Produkt in voller Länge konkurrieren und müssen möglicherweise entfernt werden, bevor das Oligonukleotid verwendet werden kann. Entsalzte Oligonukleotidpräparate eignen sich jedoch in der Regel für viele Anwendungen, wie z. B. Standard-PCR oder Microarrays, insbesondere wenn das Oligonukleotid < 20 Nukleotide lang ist.
Für Oligonukleotide, die länger als 50 Basen sind, wird eine weitere Aufreinigung empfohlen, da der Prozentsatz des Volllängenprodukts im Präparat in der Regel nicht höher als 80 % ist. Für anspruchsvolle Anwendungen, bei denen die exakte Länge des Oligonukleotids wichtig ist, wie z. B. Gel-Shift-Assays, ortsgerichtete Mutagenese, Sequenzierung, Herstellung von Klonierungsadaptern oder Erststrang-cDNA-Synthese zur Erzeugung von Bibliotheken, wird eine zusätzliche Reinigung empfohlen, selbst für kürzere Oligonukleotide (siehe weitere Informationen zu den Techniken oben unter Standard-In-vitro-Assays für Protein-Nukleinsäure-Interaktionen – Gel-Shift-Assays für RNA- und DNA-Bindung und ortsgerichtete Mutagenese).
Die Reinigung kann nach der Synthese oder nach der enzymatischen Modifikation des Oligonukleotids erforderlich sein. Hierfür gibt es mehrere Methoden, und die Wahl hängt von der Art des Oligonukleotids und der Anwendung ab, für die es bestimmt ist.
Die HPLC-Reinigung in umgekehrter Phase basiert auf der Hydrophobizität. Sie verwendet eine unpolare stationäre Phase und wässrige Puffer und organische Lösungsmittel als mobile Phase, um die Analyten zu eluieren; polare Verbindungen werden zuerst eluiert, während unpolare Verbindungen zurückgehalten werden. Dies ist die beste Methode für die Reinigung von Oligonukleotiden, die mit einer hydrophoben Gruppe modifiziert sind, wie z. B. Biotin, Fluoreszenzfarbstoff-Markierungen oder NHS-Ester-Konjugationen. Die Massenausbeute ist höher als bei der PAGE-Reinigung, und es können größere Mengen an Oligonukleotiden (im mmol-Maßstab) gereinigt werden, obwohl unvollständige Produkte nicht so effektiv entfernt werden. Oligonukleotid-Reinigungskartuschen, die auf der Umkehrphasen-Chromatographie basieren, bieten eine schnelle Methode zur Entsalzung und Reinigung von Oligonukleotiden.
Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) löst Oligonukleotide entsprechend ihrer Länge auf und bietet damit eine ausreichende Auflösung, um Produkte in voller Länge von gescheiterten Molekülen zu unterscheiden (Atkinson und Smith, 1984). Polyacrylamid-Gele sind für die Trennung kleiner DNA-Fragmente effektiver als Agarose-Gele (siehe Analyse von RNA durch analytische Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Agarose-Gelelektrophorese). Der einzige Nachteil von Polyacrylamidgelen ist, dass sie schwieriger herzustellen und zu handhaben sind als Agarosegele. Polyacrylamidgele werden in einer vertikalen Konfiguration in einem konstanten elektrischen Feld betrieben. Nach der Elektrophorese wird das Oligonukleotid aus dem Gel eluiert und durch Ethanolfällung (weitere Informationen zur Fällung von Nukleinsäuren finden Sie unter RNA-Aufreinigung – Fällungsmethoden) oder durch Umkehrphasenchromatographie konzentriert. Dies ist die Methode der Wahl, wenn der höchste Prozentsatz an Oligonukleotiden in voller Länge für anspruchsvolle Anwendungen gewünscht wird. Sie wird auch für Oligonukleotide, die länger als 30 Basen sind, dringend empfohlen. Außerdem können mehrere Proben gleichzeitig durchgeführt werden, und es ist keine teure Ausrüstung erforderlich. Der einzige Nachteil dieser Technik ist die geringe Menge an Oligonukleotid, die pro Aufreinigung gewonnen wird. In der Regel werden Oligonukleotide in einer Größenordnung von 1 μmol oder weniger verwendet, und die Massenausbeute nach der PAGE-Reinigung beträgt < 50 % und im Falle modifizierter Oligonukleotide sogar noch weniger. Die Ausbeute ist zwar gering, aber für die meisten biochemischen Anwendungen zufriedenstellend.
Das Oligonukleotidpräparat wird auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel in einer Menge von mindestens 1 mg pro Spur aufgetragen. Der Auflösungsbereich des Gels hängt von der Konzentration des Polyacrylamids ab. Für kurze Oligonukleotide (von 15 bis 35 Basen) werden 13-15%ige Polyacrylamidgele empfohlen; für längere Oligonukleotide (von 35 bis 70 Basen) werden 8-13%ige Polyacrylamidgele empfohlen. Der Prozentsatz des Gels sollte an das verwendete System angepasst werden. Wir verwenden in der Regel das Bio-Rad Mini Protean II System und führen 15%ige Gele durch, um Oligonukleotide mit einer Länge von 25 Basen zu reinigen. Nach der Identifizierung der richtigen Bande durch UV-Visualisierung wird die Bande ausgeschnitten und aus dem Gel extrahiert.
In diesem Kapitel werden zwei verschiedene Methoden zur Aufreinigung von Oligonukleotiden aus Polyacrylamidgelen beschrieben. Die einfachste Methode ist die Elution durch Diffusion. Sie beruht auf der Bewegung von Molekülen aus einem Bereich mit höherer Konzentration in einen Bereich mit niedrigerer Konzentration. Das Ergebnis der Diffusion ist eine allmähliche Durchmischung des Materials. Diese Methode ist zwar zeitaufwendig, erfordert aber weder viel Arbeit noch eine besondere Ausrüstung. Im Wesentlichen wird die Polyacrylamidbande, die das interessierende Oligonukleotid enthält, in kleine Stücke geschnitten und mit Elutionspuffer bedeckt. Nach der Inkubation wird die DNA aus dem Überstand durch Ethanolfällung gereinigt. Die Ausbeute ist begrenzt und liegt je nach Länge des Oligonukleotids zwischen 20 und 70 %. Je mehr Elutionspuffer verwendet wird, desto mehr Oligonukleotid diffundiert aus dem Gel.
Die zweite Methode ist die Elektroelution in einen Dialysebeutel (McDonell et al., 1977). Das Gelstück, das das Oligonukleotid enthält, wird herausgeschnitten und in einen Dialysebeutel mit einem Puffer gegeben. Durch Anlegen eines elektrischen Stroms wandert die DNA aus dem Gel in den Puffer des Dialysebeutels. Das Oligonukleotid wird aus diesem Puffer wiedergewonnen und gereinigt. Mit dieser Methode kann das Oligonukleotid mit einer guten Ausbeute isoliert werden, obwohl sie zeitaufwändig ist, wenn eine große Anzahl von Proben gleichzeitig gereinigt werden soll, da jede Gelbande in einzelne Dialysebeutel eingelegt werden muss. Diese Methode eignet sich auch gut für größere DNA-Fragmente und kann sogar zur Extraktion von DNA aus Agarosegelen verwendet werden.