Przed dostępnością komputerów, określenie wartości KM i Vmax wymagało algebraicznej manipulacji podstawowym równaniem Michaelisa-Mentena. Ponieważ Vmax zbliża się asymptotycznie (patrz rysunek 8.11), nie jest możliwe uzyskanie ostatecznej wartości z typowego wykresu Michaelisa-Mentena. Ponieważ KM jest stężeniem substratu przy Vmax/2, podobnie niemożliwe jest wyznaczenie dokładnej wartości KM. Jednakże, Vmax może być dokładnie określone, jeśli równanie Michaelisa-Mentena zostanie przekształcone w takie, które daje wykres prostoliniowy. Wzięcie odwrotności obu stron równania 23 daje
Wykres 1/V0 względem 1/, zwany wykresem Lineweavera-Burka lub wykresem podwójnej odwrotności, daje linię prostą o punkcie przecięcia 1/Vmax i nachyleniu KM/Vmax (Rysunek 8.36). Punkt przecięcia na osi x wynosi -1/KM.
Rysunek 8.36
A Double-Reciprocal or Lineweaver-Burk Plot. Wykres podwójnie proporcjonalny kinetyki enzymatycznej jest generowany przez wykreślenie 1/V0 jako funkcji 1/. Nachylenie to KM/Vmax, punkt przecięcia na osi pionowej to 1/Vmax, a punkt przecięcia na osi poziomej (więcej…)
Wykresy podwójnie proporcjonalne są szczególnie przydatne do rozróżniania inhibitorów kompetycyjnych i niekompetycyjnych. W inhibicji kompetycyjnej, przechwyt na osi y wykresu 1/V0 versus 1/ jest taki sam w obecności i przy braku inhibitora, chociaż nachylenie wzrasta (Rysunek 8.37). To, że punkt przecięcia jest niezmieniony wynika z faktu, że inhibitor kompetycyjny nie zmienia Vmax. Przy wystarczająco wysokim stężeniu, praktycznie wszystkie miejsca aktywne są wypełnione przez substrat, a enzym jest w pełni sprawny. Wzrost nachylenia wykresu 1/V0 versus 1/ wskazuje na siłę wiązania inhibitora kompetycyjnego. W obecności konkurencyjnego inhibitora, równanie 31 zastępuje się równaniem
w którym jest stężeniem inhibitora, a Ki jest stałą dysocjacji kompleksu enzym-inhibitor.
Rysunek 8.37
Competitive Inhibition Illustrated on a Double-Reciprocal Plot. Wykres podwójnej proporcjonalności kinetyki enzymu w obecności (
)i braku (
) inhibitora kompetycyjnego ilustruje, że inhibitor nie ma wpływu na Vmax, ale zwiększa KM.
Innymi słowy, nachylenie wykresu zwiększa się o współczynnik (1 + /Ki) w obecności inhibitora kompetycyjnego. Rozważmy enzym o KM równym 10-4 M. W nieobecności inhibitora, V0 = Vmax/2 gdy = 10-4 M. W obecności 2 × 10-3 M inhibitora kompetycyjnego, który wiąże się z enzymem z Ki równym 10-3 M, pozorne KM (KappM ) będzie równe KM × (1 + /Ki), lub 3 × 10-4 M. Podstawienie tych wartości do równania 23 daje V0 = Vmax/4, gdy = 10-4 M. Obecność inhibitora kompetycyjnego zmniejsza więc szybkość reakcji o połowę przy tym stężeniu substratu.
W inhibicji niekompetycyjnej (rysunek 8.38) inhibitor może łączyć się z enzymem lub kompleksem enzym-substrat. W czystej inhibicji niekompetycyjnej wartości stałych dysocjacji inhibitora i enzymu oraz inhibitora i kompleksu enzym-substrat są równe (rozdział 8.5.1). Wartość Vmax jest zmniejszana do nowej wartości zwanej Vappmax, a zatem zwiększa się punkt przecięcia na osi pionowej. Nowe nachylenie, które jest równe KM/Vappmax, jest większe o ten sam współczynnik. W przeciwieństwie do Vmax, KM nie ulega zmianie pod wpływem czystej niekompetycyjnej inhibicji. Prędkość maksymalna w obecności czystego inhibitora niekompetycyjnego, Vimax, jest dana przez
Rysunek 8.38
Noncompetitive Inhibition Illustrated on a Double-Reciprocal Plot. Wykres podwójnej proporcjonalności kinetyki enzymu w obecności (
) i braku (
) inhibitora niekompetycyjnego pokazuje, że KM jest niezmieniona, a Vmax jest zmniejszona.