Breath Ketone Testing: A New Biomarker for Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Diabetic Ketosis

Abstract

Background. Aceton, kwas β-hydroksymasłowy i kwas acetooctowy to trzy rodzaje ciał ketonowych, które można znaleźć w oddechu, krwi i moczu. Wykrycie zmienionego stężenia ketonów w oddechu, krwi i moczu jest kluczowe dla rozpoznania i leczenia ketozy cukrzycowej. Celem niniejszej pracy była ocena zalet różnych metod wykrywania ketonów oraz ustalenie, czy wykrywanie stężenia ketonów w oddechu jest skuteczną i praktyczną techniką. Metody. Oznaczano stężenie acetonu w oddechu metodą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas oraz β-hydroksymaślanu we krwi pobranej z opuszki palca od 99 chorych na cukrzycę przydzielonych do grup 1 (-), 2 (±), 3 (+), 4 (++) lub 5 (+++) w zależności od stężenia ketonów w moczu. Wyniki. Stwierdzono silną zależność między stężeniem glukozy na czczo, wiekiem i ketozą cukrzycową. Stężenie acetonu w wydychanym powietrzu istotnie korelowało ze stężeniem glukozy na czczo, ketonów we krwi i moczu, LDL-C, kreatyniny i azotu mocznikowego we krwi. Wnioski. Test oddechowy na obecność ketonów charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością oraz wydaje się być nieinwazyjną, wygodną i powtarzalną metodą diagnostyki i monitorowania terapeutycznego ketozy cukrzycowej.

1. Wprowadzenie

Cukrzycowa kwasica ketonowa (DKA) jest stanem zagrożenia życia, który występuje głównie u pacjentów z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1 i jest konsekwencją braku produkcji insuliny przez komórki wysepek trzustkowych, ale może również wystąpić u pacjentów z cukrzycą typu 2 ze źle kontrolowanym stężeniem glukozy we krwi lub innymi chorobami. Ketoza cukrzycowa i kwasica ketonowa są spowodowane głównie brakiem insuliny lub niewłaściwym wzrostem stężenia glukagonu we krwi, co prowadzi do zaburzeń równowagi cukrowej, białkowej, tłuszczowej, wodnej, elektrolitowej i kwasowo-zasadowej. Zidentyfikowanie metody badawczej o wysokiej czułości i swoistości ułatwiłoby wczesne rozpoznanie i leczenie cukrzycowej kwasicy ketonowej.

Ciała ketonowe są wytwarzane podczas metabolizowania przez wątrobę kwasów tłuszczowych, w tym acetonu, β-hydroksymaślanu i kwasu acetooctowego: β-hydroksymaślan może być przekształcony w kwas acetooctowy i stanowi 78% wszystkich ketonów w organizmie, następnie kwas acetooctowy (20%) i aceton (2%). W praktyce klinicznej, przy rozpoznawaniu DKA, stężenie ketonów we krwi jest zwykle określane na podstawie stężenia ketonów w moczu. Powszechnie stosowane metody wykrywania ketonów w moczu są bardziej czułe na kwas acetooctowy niż aceton, ale mniej czułe na β-hydroksymaślan, który pojawia się najwcześniej w DKA – co wyjaśnia, dlaczego pacjenci z DKA mogą nie mieć wykrywalnych stężeń ketonów w moczu. Wydalanie ketonów z moczem może być również upośledzone u pacjentów z dysfunkcją nerek. Można argumentować, że wykrywanie ketonów w moczu nie jest odpowiednim sposobem diagnozowania DKA.

Dostępne jest badanie krwi, które mierzy stężenie β-hydroksymaślanu w surowicy, ale dużym zainteresowaniem cieszy się opracowanie sposobów pomiaru stężenia ketonów w oddechu, jako wygodnego i nieinwazyjnego narzędzia diagnostycznego, które mogłoby również ukierunkować interwencje terapeutyczne. Od dawna wiadomo, że obecność acetonu w oddechu jest skorelowana z obecnością ciał ketonowych w osoczu. Acetoacetat może być dekarboksylowany w celu wytworzenia lotnego acetonu, poza tym temperatura wrzenia acetoacetatu i kwasu β-hydroksymasłowego w wydychanym oddechu jest wyższa niż acetonu, a ich zawartość jest stosunkowo niewielka i trudna do wykrycia, dlatego wybraliśmy stężenie acetonu jako predyktor ketozy cukrzycowej. Oceniliśmy zalety różnych metod detekcji i zbadaliśmy wartość kliniczną detekcji acetonu w diagnostyce i leczeniu ketozy cukrzycowej.

2. Materiały i metody

2.1. Uczestnicy

Dziewięciu dziewięciu pacjentów z cukrzycą (49 mężczyzn i 50 kobiet; przedział wiekowy: 11-85 lat) zostało zrekrutowanych z Wydziału Endokrynologii Drugiego Szpitala Uniwersytetu Jilin w Changchun, Chiny. Zgodnie z ulotką dołączoną do opakowania detektora ketonów w moczu, zmiany koloru -, ±, +, ++ i +++ odpowiadają stężeniom odpowiednio 0 mmol/L, 0,5 mmol/L, 1,5 mmol/L, 3,9 mmol/L i 7,8 mmol/L. Na podstawie stężenia ketonów w moczu pacjentów podzielono na 5 grup: grupa 1 (-), keton w moczu rejestrowany jako ujemny, 9 mężczyzn i 10 kobiet (); grupa 2 (±), keton w moczu rejestrowany jako łagodnie dodatni, 7 mężczyzn i 9 kobiet (); grupa 3 (+), keton w moczu rejestrowany jako dodatni, 14 mężczyzn i 11 kobiet (); grupa 4 (++), keton w moczu średnio dodatni, 9 mężczyzn i 10 kobiet (); oraz grupa 5 (+++), keton w moczu silnie dodatni, 10 mężczyzn i 10 kobiet (). Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyki Drugiego Szpitala Uniwersytetu Jilin, a pisemna zgoda została uzyskana od wszystkich badanych przed zebraniem oddechu.

2.2. Kryteria włączenia

Cukrzyca typu 2 została rozpoznana zgodnie z kryteriami diagnostycznymi WHO z 1999 roku. Wykluczono pacjentki z cukrzycą ciążową, cukrzycą powikłaną ciążą i cukrzycą wtórną.

2.3. Pomiar stężenia ketonów

Pobrano świeże próbki krwi z opuszki palca i zmierzono stężenie β-hydroksymaślanu we krwi za pomocą urządzenia Optium Xceed (Abbott, USA): przy użyciu sugerowanego przez producenta punktu odcięcia >0,5 mmol/L uznawano za wynik pozytywny. Do zbierania wydychanego oddechu od uczestników używaliśmy worków foliowych o pojemności 3 L, które były analizowane w ciągu 5 dni. Od każdego uczestnika uzyskano trzy próbki wydychanego powietrza. Stężenie acetonu w oddechu oznaczano za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC/MS). Czynność wykonywano zgodnie z instrukcją. Kontrola jakości wydychanego powietrza została opisana w naszej opublikowanej pracy. Stężenie ≥1,0 ppmv uznawano za pozytywne. Mierzono również stężenie ketonów w moczu oraz rejestrowano charakterystykę demograficzną i kliniczną pacjentów.

2.4. Analiza statystyczna

Wszystkie dane zostały opracowane statystycznie przy użyciu oprogramowania SPSS (wersja 17; IBM, Nowy Jork, NY, USA) i przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Porównania międzygrupowe przeprowadzono przy użyciu -testów dla danych o rozkładzie normalnym i testów nieparametrycznych dla danych o rozkładzie innym niż normalny. Do porównań międzygrupowych zastosowano analizę wariancji. Dane kategoryczne analizowano za pomocą testów chi kwadrat i wyrażano jako przypadki pozytywne i proporcje składników (%). Analizę korelacji przeprowadzono w celu zbadania siły zależności między zmiennymi. Skonstruowano krzywą ROC (receiver operating characteristic) w celu określenia optymalnej wartości odcięcia stężenia acetonu w wydychanym powietrzu i ketonu w moczu oraz obliczono czułość i swoistość. Do wszystkich analiz statystycznych zastosowano testy dwustronne. Wartość < 0,05 uznawano za istotną statystycznie.

3. Wyniki

3.1. Charakterystyka demograficzna i kliniczna uczestników

Dane demograficzne i kliniczne przedstawiono w tabeli 1. Stężenie glukozy na czczo (FBG) przy przyjęciu było istotnie wyższe w grupie 5 niż w grupach 1, 2, 3 i 4 (, , , i , , resp.), ale nie było różnic między grupami 1-4. Pacjenci w grupie 5 byli istotnie młodsi niż w grupach 1-3 (, , i , resp.), a pacjenci w grupie 4 byli również młodsi niż w grupie 2 (), ale nie było istotnych statystycznie różnic w wieku między pozostałymi grupami. Ponadto nie stwierdzono istotnych różnic w zakresie płci, wskaźnika masy ciała, stężenia hemoglobiny A1c (HbA1c) we krwi, stężenia cholesterolu całkowitego (TC), triglicerydów (TG), cholesterolu lipoprotein o małej gęstości (LDL-C), cholesterolu lipoprotein o dużej gęstości (HDL-C), aminotransferazy asparaginianowej (AST), aminotransferazy alaninowej (ALT), kreatyniny (Cr) i stężenia azotu mocznikowego we krwi (BUN) pomiędzy którąkolwiek z pięciu grup.

3.2. Comparison of Blood and Breath Concentrations of Ketones

Concentrations of blood β-hydroxybutyrate and exhaled acetone are shown in Table 2 and Figure 1. Stężenie β-hydroksymaślanu we krwi było istotnie wyższe w grupach 4 i 5 niż w grupach od 1 do 3 (, , i , resp., i , , i , resp.) oraz wyższe w grupie 5 niż w grupie 4 (), ale nie było różnic między grupami od 1 do 3. Stężenie acetonu w wydychanym powietrzu było wyższe w grupie 4 niż w grupach 1 i 3 (, i , resp.) oraz wyższe w grupie 5 niż w grupach od 1 do 4 (, , i , resp.), ale nie było różnic między pozostałymi grupami. Stężenie β-hydroksymaślanu we krwi było dodatnie w 6,7%, 14,3%, 43,5%, 71,4% i 89,5% przypadków, odpowiednio w grupach od 1 do 5, a stężenie acetonu w wydychanym powietrzu było dodatnie w 18,8%, 20%, 60%, 80% i 92,9% przypadków, odpowiednio w grupach od 1 do 5 (Tabela 3).

(a) Blood β-hydroxybutyrate concentrations

(b) Exhaled acetone concentrations , #

(a) Blood β-hydroxybutyrate concentrations
(b) Exhaled acetone concentrations , #

Figure 1

Blood β-hydroxybutyrate and exhaled acetone concentrations in patients with increasing concentrations of urinary ketones.

3.3. Correlation of Urinary Ketone Concentration with Exhaled Breath Acetone

The exhaled acetone concentration was significantly correlated with the concentrations of FBG (, ), blood β-hydroxybutyrate (, ), urinary ketone concentration (, ), LDL-C (, ), Cr (, ), and BUN (, ) (Table 4).

3.4. Exhaled Acetone Concentration as a Predictor of Diabetic Ketosis

Concentrations of blood β-hydroxybutyrate served as the standard to assess the sensitivity and specificity of exhaled acetone for detection of diabetic ketosis (Figure 2). The area under the curve (AUC) was 0.905 (), and the cut-off concentration of exhaled acetone for diagnosis of diabetic ketosis was 1.185 ppmv, with a sensitivity and specificity of 90.9% and 77.1%, respectively. Concentrations of blood β-hydroxybutyrate served as the standard to assess the sensitivity and specificity of urinary ketone for detection of diabetic ketosis (Figure 2). Obszar pod krzywą (AUC) wynosił 0,815 (), a stężenie odcięcia ketonu w moczu dla rozpoznania ketozy cukrzycowej wynosiło 2,7 mmol/l, z czułością i swoistością wynoszącą odpowiednio 63,6% i 85,7%.

Rycina 2

Krzywa charakterystyki operacyjnej (ROC) dla stężenia acetonu w wydychanym powietrzu i ketonu w moczu dla rozpoznania ketozy cukrzycowej.

4. Dyskusja

Ketokwasica może wystąpić u pacjentów z cukrzycą w każdym wieku . Badanie przeprowadzone w Austrii wskazało, że częstość występowania DKA była ujemnie skorelowana z wiekiem . Klingensmith i współpracownicy podali, że młodszy wiek, brak prywatnego ubezpieczenia zdrowotnego i afroamerykańskie dziedzictwo rodowe są niezależnymi czynnikami ryzyka DKA. W naszym badaniu młodsi pacjenci i wyższe stężenie FBG miały tendencję do silnego pozytywnego wyniku dla ketonów w moczu, co jest zgodne z danymi zgłoszonymi.

Detekcja wydychanego powietrza była stosowana do diagnozowania chorób metabolicznych i monitorowania leczenia przez wiele lat. Techniki stosowane do wykrywania tych związków w wydychanym oddechu opierają się na spektrometrii mas, na przykład spektrometrii masowej z reakcją przeniesienia protonu, spektrometrii masowej z wybranym przepływem jonów w rurze, spektroskopii z pierścieniem wnęki. Stężenie acetonu w oddechu jest związane z metabolizmem glukozy i lipolizą. Wcześniejsze badania wykazały ścisłą korelację pomiędzy stężeniem ketonów uwalnianych ze skóry a stężeniem we krwi. Stężenie acetonu w oddechu jest również podwyższone w cukrzycy typu 2 i może być wykorzystywane do diagnozowania początku cukrzycy. Do wykrywania acetonu w wydychanym powietrzu zastosowano metodę GC/MS, która umożliwia wykrycie ponad 200 składników wydychanego powietrza i jest wysoce czuła na typowe lotne związki organiczne. Analiza korelacji wykazała, że stężenie acetonu w wydychanym powietrzu było istotnie związane ze stężeniem ketonów w moczu, stężeniem FBG, LDL-C, Cr i BUN we krwi. Szybko wydychany aceton może być lepszym wskaźnikiem odzwierciedlającym zmiany stężenia glukozy we krwi, a badanie stężenia wydychanego acetonu jest nieinwazyjną, prostą metodą, która w przyszłości może stać się obiecującym wskaźnikiem monitorowania stężenia glukozy we krwi.

Gdy stężenie β-hydroksymaślanu we krwi służyło jako standard w naszym badaniu do oceny czułości i swoistości wydychanego acetonu i ketonu w moczu, czułość i swoistość wydychanego acetonu wynosiła odpowiednio 90,9% i 77,1%. Jednakże czułość i swoistość ketonu w moczu wynosiły odpowiednio 63,6% i 85,7%. Wyniki te pokazują, że swoistość acetonu wydychanego jest podobna do ketonu w moczu, ale jego czułość jest wyższa niż ketonu w moczu. Ponadto, badanie stężenia β-hydroksymaślanu we krwi i acetonu w wydychanym powietrzu jest nadal pozytywne w grupie negatywnej dla ketonów w moczu; odsetek ten wynosi odpowiednio 6,7% i 18,8%. Tak więc stężenie ketonów w moczu może nie być aktualnym predyktorem wczesnej cukrzycowej ketozy. Badanie krwi i wydychanego powietrza na obecność ketonów pomaga wyeliminować wyniki fałszywie ujemne. Inną potencjalną wartością badania stężenia ketonów w oddechu jest to, że jest ono silnie uzależnione od czynników fizjologicznych innych niż dieta. W prezentowanej metodzie u pacjentów z ketozą cukrzycową stwierdzono stężenie acetonu w wydychanym powietrzu wyższe niż 1,185 ppmv; detekcja wymaga jedynie prostego przygotowania i nie wymaga użycia rozpuszczalnika organicznego. Analiza wydychanego acetonu okazuje się być nieinwazyjną, wygodną, czułą i bezrozpuszczalnikową metodą, która może być stosowana do diagnozowania i monitorowania ciężkości ketozy cukrzycowej. Jednakże technika ta jest nadal wstępna i jej szerokie zastosowanie kliniczne wymaga dalszej optymalizacji.

Konflikt interesów

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych finansowych i osobistych powiązań z innymi osobami lub organizacjami. Oświadczają również, że nie istnieje żaden konflikt interesów dotyczący publikacji tej pracy.

Podziękowania

Badanie to było wspierane przez NSFC Grant (nr 30971398 i nr 81170746) oraz Norman Bethune Program of Jilin University (nr 2012214).