Distinct fibroblast subsets regulate lacteal integrity through YAP/TAZ-induced VEGF-C in intestinal villi

Zwierzęta doświadczalne

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury doświadczalne były zgodne ze wszystkimi przepisami etycznymi dotyczącymi badań i testów na zwierzętach pod zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (No. KA2016-12) z Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Myszy Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 i Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 zostały przeniesione, założone i wyhodowane w pomieszczeniach dla zwierząt wolnych od specyficznych patogenów (SPF) w KAIST. Myszy C57BL/6 J, R26-tdTomato i Myh11-Cre-ERT2 zostały zakupione z Laboratorium Jacksona. Wszystkie myszy były utrzymywane na tle C57BL/6 i karmione swobodnym dostępem do standardowej diety (PMI LabDiet) i wody. W celu wywołania aktywności Cre u myszy Cre-ERT2, 2 mg tamoksyfenu (Sigma-Aldrich) rozpuszczonego w oleju kukurydzianym (Sigma-Aldrich) wstrzykiwano dootrzewnowo (i.p.) we wskazanych punktach czasowych dla każdego eksperymentu. Myszy Cre-ERT2 negatywne, ale flox/flox-pozytywne wśród swoich odpowiedników, zostały zdefiniowane jako myszy kontrolne (WT) dla każdego eksperymentu. Myszy zostały znieczulone za pomocą i.p. iniekcji kombinacji środków znieczulających (80 mg/kg ketaminy i 12 mg/kg ksylazyny) przed uśmierceniem.

Analizy histologiczne

Do barwienia jelita cienkiego metodą whole-mount, wykonano perfuzję przezskórną z 2% paraformaldehydem (PFA) po znieczuleniu. Jelito cienkie zostało pobrane i przecięte wzdłuż, aby odsłonić światło. Po kilkukrotnym przepłukaniu PBS, jelita przypinano na silikonowych płytkach. Następnie próbki utrwalano w temperaturze 4 °C w 4% PFA przez 2 h. Próbki przemywano kilkakrotnie PBS, a następnie odwadniano 10% sacharozą w PBS przez 2 h oraz 20% sacharozą, 10% glicerolem w PBS przez noc. Skórę ucha, tchawicę i przeponę pobierano bez perfuzji przezsercowej i utrwalano w 4% PFA przez 1 h w 4 °C. Próbki przemywano PBS kilka razy przed zablokowaniem. Po zablokowaniu 5% surowicą kozią lub oślą w 0,5% Triton-X 100 w PBS (PBST) przez 1 h, próbki inkubowano ze wskazanymi przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc. Po kilkukrotnym przemyciu PBST, próbki inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT) ze wskazanymi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluorochromem, rozcieńczonymi w buforze blokującym. Próbki przemywano PBST, a jądra wybarwiano DAPI (Invitrogen). Po płukaniu PBS, próbki montowano za pomocą Vecta-shield (Vector Laboratories). Obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 800 lub LSM 880 (Carl Zeiss).

Do barwienia immunologicznego użyto następujących przeciwciał pierwotnych i wtórnych: antyLYVE-1 (poliklonalne królicze, 11-034, Angiobio, 1:400); anty-CD31 (monoklonalne szczurze, 557355, BD Biosciences, 1:400); anty-CD31 (monoklonalny chomika, MAB1398Z, Merck, 1:400); anty-E-kadheryna (poliklonalny kozi, AF748, R&D, 1:200); anty-Prox1 (poliklonalny kozi, AF2727, R&D, 1:400); anty-Prox1 (rabbit polyclonal, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anty-VE-cadherin (goat polyclonal, AF1002, R&D, 1:200); anty-PDGFRβ (rat monoclonal, ab91066, Abcam, 1:200); anty-PAI-1 (mysi monoklonalny, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anty-Serpina3n (kozi poliklonalny, AF4709, R&D, 1:200); anty-Fosb (króliczy monoklonalny, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anty-Shisa3 (poliklonalny królika, TA320118, Origene, 1:400); anty-P2X1 (poliklonalny królika, APR-001, Alomone labs, 1:800); anty-Ackr4 (poliklonalny królika, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anty-Grem1 (kozi poliklonalny, AF956, R&D, 1:200); anty-Sox6 (króliczy poliklonalny, ab30455, Abcam, 1:400); anty-PDGFRα (kozi poliklonalny, AF1062, R&D, 1:200); anty-YAP (monoklonalny królika, 14074, Cell signaling, 1:200); antyTAZ (poliklonalny królika, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); anty-αSMA, skoniugowany izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) (monoklonalny myszy, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anty-VEGFR3 (kozi poliklonalny, AF743, R&D, 1:200); anty-VEGFR2 (kozi poliklonalny, AF644, R&D, 1:200); anty-PPGP9.5 (monoklonalny królika, 13179, Cell signaling, 1:400); anty-F4/80, FITC-conjugated (monoklonalny szczura, 1231007, Biolegend, 1:200); anty-CD3 (monoklonalny chomika, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anty-Desmina (poliklonalny królika, AB907, Millipore, 1:400); i przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647- sprzężone z przeciwciałami anty-rabbit, anty-szczur, anty-koz, anty-chamster (rozcieńczone w stosunku 1:1000) zostały zakupione od Jackson ImmunoResearch. Wszystkie przeciwciała użyte w naszych badaniach zostały zwalidowane dla danego gatunku i zastosowania.

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH)

Dla smFISH jelita cienkiego, po znieczuleniu wykonywano perfuzję przezskórną z 2% PFA. Próbki utrwalano w 4 °C w 4% PFA przez 2 h. Próbki przemywano kilkakrotnie PBS, przenoszono do 30% sacharozy i inkubowano przez noc. Próbki zatopione w OCT były sekcjonowane i wykonywaliśmy smFISH zgodnie z protokołem producenta, który jest opisany w zestawie RNAscope Fluorescent Multiplex Assay kit (320850, ACDBio). Sonda RNA scope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) została użyta do smFISH. Następujące przeciwciała pierwotne i wtórne zostały użyte w barwieniu immunologicznym z użyciem smFISH: anty-PDGFRβ (szczur monoklonalny, ab91066, Abcam); anty-Shisa3 (królik poliklonalny, TA320118, Origene); anty-P2X1 (królik poliklonalny, APR-001, Alomone labs) oraz przeciwciała drugorzędowe skoniugowane Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647- zakupiono w firmie Jackson ImmunoResearch. Obrazy uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 800 lub LSM 880 (Carl Zeiss).

Atest inkorporacji EDU dla proliferujących LEC

Aby wykryć proliferujące LEC w mleczu, 5 mg 5-etynylo-2′-deoksyurydyny (EdU, A10044, Invitrogen) rozpuszczono w 1 ml wody Milli-Q jako roztwór podstawowy. Następnie, 200 μl roztworu podstawowego na mysz wstrzykiwano i.p. co drugi dzień przez tydzień przed analizą. Jelito cienkie zostało wyizolowane i przetworzone jak opisano powyżej. Komórki inkorporowane EdU były wykrywane za pomocą Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta.

Mikroskopia elektronowa

Aby uchwycić ultrastrukturalne obrazy mikroskopii elektronowej mlecza, jelito cienkie było sekcjonowane po perfuzji przezskórnej z 4% PFA i 0,25% glutaraldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4). Próbki były następnie utrwalane na noc w 2,5% aldehydzie glutarowym, utrwalane 1% tetratlenkiem osmu i odwadniane serią wzrastających stężeń etanolu, po czym następowało osadzanie na żywicy. 70-nm ultracienkie skrawki laktozy uzyskano za pomocą ultramikrotomu (UltraCut-UCT, Leica), które następnie zebrano na miedzianych siatkach. Próbki obrazowano za pomocą EM transmisyjnego (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) przy 120 kV po wybarwieniu 2% octanem uranylu i cytrynianem ołowiu.

Wskazania przyżyciowe klirensu lipidów z lamina propria

Myszy były znieczulane po usunięciu pokarmu przez 12 h przed procedurą. Obrazowanie przyżyciowe przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem34. Krótko mówiąc, sondy lipidowe BODIPY (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) rozpuszczono w 2,5% roztworze DMSO (Sigma-Aldrich). Anti-LYVE-1 (szczur monoklonalny, 223322, R&D) skoniugowany z przeciwciałem Alexa Fluor 647 (Invitrogen) (0,75 mg/kg) wstrzyknięto dożylnie na 12 h przed obrazowaniem w celu fluorescencyjnego znakowania mleczaków. Następnie, proksymalne jelito czcze było eksterioryzowane w komorze obrazowania, gdzie temperatura była utrzymywana na poziomie 37 °C podczas obrazowania. Po chirurgicznym otwarciu światła jelita na 1,5 cm wzdłuż granicy antymesenterycznej, na odsłoniętym świetle umieszczano szkiełko nakrywkowe w celu uzyskania widoku kosmków. Obrazowanie przyżyciowe przeprowadzono w trzech sesjach. Najpierw obrazowano kosmki przed podaniem BODIPY-FA w czasie 0 min. Następnie, 30 μl sond lipidowych BODIPY dostarczono raz przed drugą sesją obrazowania, aby obserwować początkową absorpcję lipidów BODIPY w 1 minucie. Następnie, lipidy BODIPY podawano trzykrotnie w odstępach 2 min przed trzecią sesją obrazowania w 26 minucie, a oczyszczanie BODIPY-FA przez kanaliki mlekowe analizowano w 36 minucie i 46 minucie. Zastosowano domowej konstrukcji laserowy skaningowy mikroskop konfokalny34. Dwa lasery o fali ciągłej emitujące przy 488 nm (MLD, Coherent) i 640 nm (Cube, Coherent) zostały użyte jako źródła wzbudzenia do obrazowania fluorescencji. Dwa filtry pasmowo-przepustowe (FF01-525/50 i FF01-685/40, Semrock) służyły do detekcji sygnałów fluorescencyjnych. Rozdzielczość osiowa poniżej 4 μm była uzyskiwana przy użyciu 100 μm pinhole i obiektywu 60x (LUMFLN, immersja wodna, NA 1.1, Olympus). Obrazy (512 × 512 pikseli) uzyskano przy częstotliwości odświeżania 30 Hz. W celu poprawy stosunku sygnału do szumu obrazu, szumy z 90 klatek po post-processingu obrazów w czasie rzeczywistym (30 klatek/sek.) zostały uśrednione przez usunięcie artefaktu ruchowego generowanego przez perystaltykę za pomocą napisanego na zamówienie programu MATLAB. Oprogramowanie ImageJ (NIH) zostało użyte do pomiaru średniej intensywności fluorescencji w lamina propria.

Test absorpcji lipidów

Po usunięciu pokarmu na 12 h, 200 μl oliwy z oliwek (Sigma-Aldrich) podano doustnie do pomiaru triglicerydów w osoczu i barwienia Oil Red O. Próbki krwi pobierano przez żyłę ogonową do probówki zawierającej heparynę w 0, 1, 2, 3 i 4 h po podaniu oliwy z oliwek. Stężenie triglicerydów w osoczu mierzono przy użyciu analizatora VetTest Chemistry (IDEXX Lab). Jelito cienkie zabarwiono czerwienią olejową O w 12 h po podaniu oliwy z oliwek zgodnie z protokołem producenta zestawu do barwienia czerwienią olejową O (MAK194, Sigma-Aldrich). Karmienie dietą wysokotłuszczową (HFD) (60% kcal tłuszczu, Research Diets, D12492) rozpoczęto w 12 tygodniu życia i kontynuowano przez 8 tygodni w celu pomiaru triglicerydów w osoczu i barwienia Oil Red O. Próbki krwi pobierano przez żyłę ogonową do probówki zawierającej heparynę po 6 godzinach na czczo. Do barwienia Oil red O sekcji wątroby, wątroby zebrano, utrwalono w 4% PFA przez noc w 4 ° C, pocięto na sekcje wibratomowe 100 μm (Leica, VT1200S), zabarwiono za pomocą Oil red O.

Transdukcja AAV

Indykowane myszy otrzymały pojedynczą i.p. dawkę (1012 cząstek wirusowych w 150-200 µl) rekombinowanego AAV kodującego domeny 1-4 VEGFR3 wiążące ligand, sprzężone z domeną Fc IgG (AAV-mVEGFR31-4-Ig), a myszy kontrolne otrzymały taką samą dawkę AAV kodującego domeny 4-7 VEGFR3, które nie wiążą VEGF-C ani VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), sprzężone z domeną Fc IgG, jak opisano wcześniej37. AAV-mVEGFR31-4-Ig i AAV-mVEGFR34-7-Ig wykryto w surowicy przez analizę immunoblottingu (przeciwciało anty-VEGFR3; kozie poliklonalne, AF743, R&D) z 0.5 μl próbek surowicy zebranych w tym samym dniu analizy jelitowej.

Traktowanie przeciwciałem

Do blokady VEGFR2 użyliśmy przeciwciała neutralizującego VEGFR2 (DC101). Linia komórkowa hybridoma, która produkuje DC101 została zakupiona z American Type Culture Collection (ATCC). Komórki hybridoma hodowano w podłożu wolnym od surowicy. Białka rekombinowane w supernatantach oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej z użyciem żelu agarozowego Protein A (Oncogene). Po oczyszczeniu, rekombinowane białka były oznaczane ilościowo przy użyciu testu Bradforda i potwierdzane przez barwienie błękitem Coomassie po elektroforezie w żelu dodecylosiarczanu sodu (SDS)-poliakrylamidowym (PAGE). DC101 (50 mg/kg) lub taką samą ilość przeciwciała kontrolnego (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) wstrzykiwano i.p. wskazanym myszom co 2 dni przez 2 tygodnie.

Wzbogacanie jelitowych LEC i izolacja IntSC z jelita cienkiego

Z jelita cienkiego usunięto błonę surowiczą, warstwę mięśniową i tkanki tłuszczowe krezki. Po podłużnym otwarciu fragmentów jelita i przemyciu PBS, próbki krojono na 2 cm kawałki i usuwano płaty Peyera. Próbki płukano PBS i inkubowano z 10 mM EDTA z DMEM bez wapnia i magnezu (Gibco) na lodzie przez 20 min. Tkanki wirowano w PBS bez wapnia, aż do uzyskania klarownego supernatantu pozbawionego komórek nabłonka. Próbki pocięto na 1 mm fragmenty i zdysocjowano buforem dysocjacyjnym zawierającym 2 mg/ml kolagenazy II (Worthington), 1 mg/ml Dispase (Gibco) i 1 U/ml DNase (Invitrogen) w DMEM w 37 °C przez 30 min. Aby ułatwić dysocjację, fragmenty tkanek były delikatnie pipetowane w górę i w dół co 10 min. Następnie próbki były filtrowane przez sitko 70 μm, aby mechanicznie rozdzielić pozostałe fragmenty jelita. Po zebraniu supernatantów dodawano równą objętość DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Po odwirowaniu, komórki ponownie zawieszano w PBS. W celu wzbogacenia frakcji komórek zrębu i LEC, komórki hematopoetyczne i nabłonkowe usuwano przy użyciu AutoMACS (Miltenyi) po inkubacji przez 15 min na lodzie z anty-CD45 i anty-CD326 Microbeads (Miltenyi). Do izolacji IntSC, oprócz mikrokulek anty-CD45 i anty-CD326, dodano mikrokuleczki anty-CD31 (Miltenyi) w celu usunięcia komórek śródbłonka.

Hodowla pierwotna mysich IntSCs

Po izolacji IntSCs, komórki hodowano w DMEM/F12 zawierającym 10% FBS na płytce do hodowli tkankowych przez 24 h lub 2 dni. W celu leczenia lekami i barwienia immunofluorescencyjnego, 50 000 komórek na studzienkę umieszczono na 4-studzienkowych szkiełkach komorowych Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich). Stężenia leków opisano we wskazanych legendach figur, a zabiegi trwały 6 h dla immunofluorescencji i analizy ekspresji genów. Do hodowli IntSC na miękkich (1,5 kPa) i sztywnych (28 kPa) matrycach użyto 35-mm szalki z powierzchnią elastycznie podpartą (Ibidi) przez 24 h. W celu indukcji aktywności cre w pierwotnie hodowanych IntSC pochodzących od myszy WT lub Yap/Tazi∆FRC, komórki traktowano 5 µM 4-hydroksy-tamoksyfenu (4-OHT) w 100% etanolu (EtOH) lub samym 100% EtOH przez 2 dni jako kontrolę. Do eksperymentów użyto hodowlanych monowarstw IntSCs, które zostały zweryfikowane jako PDGFRβ+.

Cytometria przepływowa i sortowanie komórek

Aby posortować PDGFRβ+ IntSCs lub jelitowe LECs, wzbogacone frakcje poddano lizie RBC poprzez zawieszenie w buforze do lizy ACK (Gibco) przez 5 min w RT. Po zablokowaniu receptorów Fcγ mysim anty-CD16/CD32 (553141, BD Bioscience), komórki inkubowano przez 15 min ze wskazanymi przeciwciałami w buforze FACS (2% FBS w PBS). Po kilkukrotnym płukaniu, komórki analizowano za pomocą FACS Canto II (BD Biosciences), a uzyskane dane poddawano dalszej ocenie za pomocą oprogramowania FlowJo (Treestar). Sortowanie komórek przeprowadzono za pomocą FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Martwe komórki zostały wykluczone przy użyciu barwienia DAPI (Sigma-Aldrich), a podwojenia komórek były systematycznie wykluczane. Intensywność fluorescencji jest wyrażona w jednostkach arbitralnych w skali logarytmicznej, a rozproszenie do przodu i rozproszenie na boki są przedstawione w skali liniowej. Do cytometrii przepływowej użyto następujących przeciwciał: FITC anty-mouse CD45 (11-0451-85, monoklonalny szczur, Biolegend); FITC anty-mouse TER-119 (11-5921-85, monoklonalny szczur, Biolegend); APC anty-mouse CD31 (551262, monoklonalny szczur, BD Bioscience); i PE/Cy7 anty-mouse Podoplanin (127412, monoklonalny chomik syryjski, Biolegend).

Sekwencjonowanie zbiorcze RNA

Sekwencjonowanie zbiorcze RNA wyizolowanych PDGFRβ+ IntSCs przeprowadzono po uzyskaniu pliku wyrównania. W skrócie, odczyty mapowano przy użyciu oprogramowania TopHat. Plik wyrównania został wykorzystany do złożenia transkryptów, oszacowania ich obfitości oraz wykrycia różnicowej ekspresji genów lub izoform przy użyciu cufflinków. Narzędzie Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) zostało użyte do dalszej oceny danych w kontekście sygnalizacji kanonicznej i określenia, czy geny YAP/TAZ-hyperaktywowane były specyficznie związane z cząsteczkami wydzielniczymi. Istotność sygnalizacji kanonicznej testowano za pomocą procedury Benjamini-Hochberg, która dostosowuje wartość P do korekty dla wielokrotnych porównań, a ich aktywację lub inhibicję określano w odniesieniu do z-scores aktywacji. Analiza skupień i mapy cieplne zostały wygenerowane przy użyciu programu Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Do GSEA wykorzystano kolekcje zestawów genów z Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/).

MEFs i HDLECs

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) izolowano z embrionów E12,5 jak wcześniej opisano32. Krótko mówiąc, usunięto tkankę głowy, kończyn i serca, a próbki rozdrobniono nożyczkami i trawiono 0,1% trypsyną/EDTA z DNazą (1 U/ml, Invitrogen) w temperaturze 37 °C przez 20 min. Po trawieniu i usunięciu niestrawionych tkanek, komórki krótko odwirowywano, umieszczano na 10 cm płytce i pozwalano im rosnąć do subkonfluencji. MEF były następnie hodowane w DMEM/F12 zawierającym 10% FBS. Human dermal lymphatic lymphatic endothelial cells (HDLECs) zakupiono od firmy Lonza i hodowano w medium wzrostu śródbłonka (EGM2-MV, Lonza). MEFs i HDLECs używano w stadium 2 lub 3. Komórki inkubowano w nawilżonej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37°C i potwierdzono ich mykoplazmoujemność (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Spheroid-based sprouting assay

Sferoidy HDLEC generowano poprzez hodowlę HDLEC w stadium 2 lub 3 w podłożu hodowlanym zawierającym 0,25% metylocelulozy i inkubację przez noc jako wiszące krople36. Sferoidy były następnie zbierane i osadzane w 2 mg/ml kolagenie typu I (Corning), traktowane kontrolną surowiczą albuminą bydlęcą (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) lub ANGPT2 (5 μg/ml, in-house generated) z lub bez VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) w Endothelial Cell Basal Medium (PromoCell) zawierającym 1% FBS przez 24 h. Pod koniec inkubacji sferoidy wybarwiano za pomocą cell trackera (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 min). Następnie sferoidy utrwalano w 4% PFA przez 15 min w RT i obrazowano przy użyciu programu Cell observer (Carl Zeiss).

Ilościowy RT-PCR

RNA ekstrahowano przy użyciu RNeasy Micro kit (Qiagen) lub Trizol RNA extraction kit (Invitrogen). Całkowita ilość 1 µg wyekstrahowanego RNA została przepisana na cDNA przy użyciu GoScript Reverse Transcription Kit (Promega). Ilościową PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu FastStart SYBR Green Master mix (Roche) i termocyklera S1000 (Bio-Rad) ze wskazanymi starterami. Startery zostały zaprojektowane przy użyciu Primer-BLAST lub zaadoptowane z wcześniej opublikowanych badań, które zostały opisane w Tabeli 1. Gapdh został użyty jako gen referencyjny, a wyniki przedstawiono jako względną ekspresję do kontroli. Specyficzność reakcji primerów potwierdzono analizą krzywej topnienia. Względną ekspresję genów analizowano metodą ΔΔCt przy użyciu oprogramowania CFX Manager (Bio-Rad).

Doświadczenia rozciągania i osmotyczne in vitro

MEFs i pierwotne mysie IntSCs rozciągano przy użyciu mechanicznego urządzenia do rozciągania komórek (STREX) z 4% liniowym rozciąganiem przy 10 cyklach/min, a stres osmotyczny stosowano z 0,4 M sorbitolem przez 3 h, jak opisano wcześniej40,50. Komórki były trzymane w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C podczas wszystkich eksperymentów.

Doświadczenia osmotyczne ex vivo

Po otwarciu jamy brzusznej w znieczuleniu, część jelita cienkiego pocięto na 2 cm kawałki. Fragmenty jelita otwierano podłużnie i płukano PBS. Tkanki hodowano w DMEM/F12 zawierającym 5% FBS i natychmiast stosowano stres osmotyczny, dodając 0,4 M sorbitolu do podłoża hodowlanego przez 3 h. Tkanki przechowywano w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37°C podczas wszystkich eksperymentów.

Barwienie immunofluorescencyjne MEFs

MEFs umieszczano na 8-studzienkowych szkiełkach komorowych Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich) i utrwalano 4% paraformaldehydem przez 15 min w 4 °C. Po kilkukrotnym przepłukaniu PBS, próbki blokowano 5% kozią (lub oślą) surowicą w 0,5% PBST przez 30 min w temperaturze RT. Komórki inkubowano ze wskazanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze 4 °C przez noc. Związane przeciwciała pierwszorzędowe były wykrywane przez inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi przez 90 min przy RT. Do barwienia komórek użyto następujących przeciwciał pierwszorzędowych: anty-YAP (monoklonalne królicze, 14074, Cell signaling); anty-TAZ (poliklonalne królicze, HPA007415, Sigma-Aldrich); oraz przeciwciała Alexa Fluor 488 sprzężone z antyfalloidyną (A12379, Thermo Fisher). Przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z Alexa Fluor 594 zostały zakupione od Jackson ImmunoResearch. Jądra wybarwiano DAPI (Invitrogen), a szkiełka montowano i obrazowano jak opisano powyżej.

ChIP-qPCR

MEFs utrwalano 1% PFA przez 10 min i hartowano glicyną. Próbki przemywano PBS i lizowano buforem lizującym zawierającym 1% SDS. Utrwalone DNA w lizatach komórkowych poddano sonikacji przy użyciu Focused-ultrasonicator (Covaris). Lizaty komórkowe odwirowywano, a wszystkie z wyjątkiem 5% (zachowane do kontroli wejściowego lizatu całokomórkowego) uzyskane supernatanty rozcieńczano buforem do rozcieńczania ChIP zawierającym 0,5% Triton X-100. Rozcieńczone próbki były następnie inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem anty-TEAD4 (mysie monoklonalne, ab58310, Abcam). Następnie dodawano białko A/G Dynabeads (Thermo Fisher) i próbki inkubowano przez 2 h w temp. 4 °C. Kulki izolowano za pomocą DynaMag-2 (Thermo Fisher), przemywano seriami buforów do przemywania ChIP: buforem do przemywania o niskiej zawartości soli, buforem do przemywania o wysokiej zawartości soli, buforem do przemywania LiCl i buforem TE. Próbki eluowano w 1% SDS dwa razy po 15 min w temp. 65 °C. Usunięto kulki i zarówno eluowany materiał, jak i wejściowe próbki 5% lizatu całokomórkowego poddano odwrotnemu sieciowaniu przez noc w temperaturze 65 °C. Po normalizacji pH, próbki inkubowano przez 30 min z RNazą (3 μg/mL) w 37 °C oraz przez 2 h z proteinazą K (20 mg/ml) i glikogenem (20 mg/ml) w 55 °C. DNA eluowano przy użyciu standardowych procedur, a ChIP-DNA analizowano metodą qPCR w porównaniu z próbkami wejściowymi przy użyciu primerów wymienionych w Tabeli Dodatkowej 2.

ELISA

Supernatant z pierwotnie hodowanych mysich IntSCs zbierano po rozciągnięciu, a supernatant odwirowywano przez 15 min. Stężenie VEGF-C w supernatancie mierzono metodą ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) przy użyciu mysiego zestawu ELISA specyficznego dla VEGF-C (CSB-E07361m, Cusabio).

Analiza morfometryczna

Pomiary morfometryczne wykonano przy użyciu oprogramowania ImageJ (NIH), oprogramowania ZEN 2012 (Carl Zeiss) lub Imaris (Bitplane). Dla kwantyfikacji powierzchni mleczka ustawiono próg dla obrazów do analizy i zmierzono bezwzględną powierzchnię kosmka LYVE-1+ dla każdego mleczka w obrębie kosmka. Bezwzględna długość mleczka, bezwzględna długość kosmków i bezwzględna szerokość kosmków były mierzone przy użyciu obrazów barwienia immunologicznego E-kadheryny+ lub CD31+ lub LYVE-1+ w każdym losowo wybranym polu 850 µm2 we wskazanej części jelita. Dla kwantyfikacji powierzchni mleczka i kosmków, długości i szerokości, analizowano co najmniej 100 kosmków w całym jelicie cienkim. W jelicie cienkim przeprowadzono kwantyfikację następujących parametrów w jelicie czczym. Liczba kiełków mlekowych i liczba rozgałęzień mlekowych była mierzona w 10-20 losowych mleczakach LYVE-1+. Liczbę Prox1+ LECs i liczbę Prox1+EdU+ LECs liczono ręcznie w obrębie 100 μm długości 10-20 losowo wybranych LYVE-1+leczaków. Quantification of VE-cadherin+ junctions of lacteal was performed with ×40 objective lens in lacteals of 5-10 villi per mouse. W skrócie, połączenia typu „zipper” zdefiniowano jako ciągłe połączenia na granicy komórka-komórka z komórkami, które mają wydłużony kształt51. Połączenia typu „guzik” zdefiniowano jako nieciągłe połączenia, które nie są równoległe do granic komórka-komórka i kształtem przypominają liść dębu. Połączenia, które nie pasują do żadnego z tych wzorców, zostały zakwalifikowane jako typ mieszany. Intensywność fluorescencji (FI) BODIPY i jej kwantyfikację przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem34. Obszar czerwieni olejowej O był mierzony jako obszar czerwieni olejowej O+ podzielony przez obszar kosmków i znormalizowany przez średnią tych z myszy kontrolnych. Obszar pokrycia komórek mięśni gładkich wioski mierzono jako bezwzględny obszar pokrycia αSMA+ w pięciu polach o powierzchni 850 µm2 na próbkę, który następnie normalizowano przez średnią z pól u myszy kontrolnych. W celu ilościowego określenia względnej ekspresji VEGFR3 w mleczu, zmierzono średnie FI w pięciu polach 425 µm2 na próbkę i przedstawiono jako wartości względne podzielone przez kontrolę. Aby określić gęstość naczyń krwionośnych, obszar VEGFR2 mierzono w pięciu polach 425 µm2 na próbkę i przedstawiono jako wartości względne podzielone przez jego kontrolę. Obszar komórek T CD3+ lub makrofagów F4/80+ mierzono w pięciu polach 425 µm2 na próbkę. Gęstość naczyń limfatycznych obliczano mierząc obszar LYVE-1+ w pięciu losowych polach 425-850 µm2 z próbek whole mount i przedstawiano jako wartości względne do kontroli.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek w oparciu o krople

Sortowane pojedyncze komórki przetwarzano przy użyciu zestawu 10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) zgodnie z protokołami producenta. W skrócie, posortowane komórki zostały ponownie zawieszone w PBS z 0,5% BSA i zmieszane z mieszaniną odczynników RT i primerem RT, które następnie zostały dodane do każdego kanału w chipach 10X, celując w 5000 komórek. Komórki zostały rozdzielone na kulki żelowe w emulsji, gdzie transkrypty RNA z pojedynczych komórek zostały oznaczone kodem kreskowym i poddane odwrotnej transkrypcji. Po zbudowaniu biblioteki cDNA i amplifikacji, cząsteczki cDNA były enzymatycznie fragmentowane, naprawiane na końcach i poddawane procesowi A-tailed. Po wybraniu odpowiedniego rozmiaru przetworzonych cząsteczek cDNA poprzez podwójną selekcję rozmiaru przy użyciu kulek SPRI (Beckman Coulter), ligowano je z adaptorem i wykonywano PCR z indeksem próbki. Po kolejnej podwójnej selekcji wielkości przy użyciu kulek SPRI, końcowe konstrukty biblioteczne były rozcieńczane 10-krotnie i uruchamiane na Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip w celu kontroli jakości. Biblioteki jednokomórkowe były następnie sekwencjonowane przy użyciu platformy Illumina HiSeq-X.

Pre-processing of single-cell RNA data

Raw sequencing data were first de-multiplexed and mapped to mouse reference genome (mm10) by using Cell Ranger 3.0.2 toolkit from 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Używając pakietu R Seurat (wersja 3.0.0)52, surowe macierze ekspresji budowano przy użyciu funkcji Read10X. Wykluczono komórki, w których wykryto mniej niż 1000 genów lub więcej niż 6000 genów (traktowane jako potencjalne dublety) (Supplementary Fig. 17a). Dodatkowo, komórki o wysokiej liczbie genów związanych z genami mitochondrialnymi (UMI) (>7% ogółu) zostały uznane za komórki martwe i tym samym wykluczone. Dla genów, te wyrażone przez mniej niż 3 komórki zostały usunięte. Dodatkowo, niewielka liczba zanieczyszczających komórek immunologicznych Ptprc+ oraz komórek śródbłonka Pecam1+ Cdh5+ została wykluczona po wstępnej rundzie klasteryzacji. Po usunięciu niepożądanych komórek i genów, liczby UMI dla każdego genu dla danej komórki zostały podzielone przez całkowitą ekspresję danej komórki i pomnożone przez 10,000 oraz poddane transformacji logarytmicznej. Następnie, geny zostały wyskalowane i wyśrodkowane poprzez regresję zmiennych takich jak procent genów mitochondrialnych i liczba UMI.

Identyfikacja zmiennych genów i redukcja wymiarowości

Pakiet R Seurat został użyty do analizy skupień. Najpierw zidentyfikowano wysoce zmienne geny w całym zbiorze danych za pomocą funkcji FindVariableFeatures w pakiecie Seurat z opcją: selection.method = „vst”. Do dalszej analizy wybrano 2000 genów o najwyższej zmienności. Na podstawie zidentyfikowanych zmiennych genów przeprowadzono wstępną redukcję wymiarowości za pomocą analizy składowych głównych (PCA). Do określenia statystycznej istotności wyników PCA wykorzystano funkcję JackStraw. Najbardziej znaczące 30 głównych składowych (PCs) zostało użyte jako dane wejściowe dla Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) w celu redukcji danych do przestrzeni dwuwymiarowej.

Analiza skupień

W celu pogrupowania komórek według ich profili transkrypcyjnych, przeprowadziliśmy nienadzorowane grupowanie na 2000 wysoce zmiennych genów dla wszystkich czterech próbek. Najpierw zbudowaliśmy graf SNN (shared nearest neighbors) na przestrzeni składowych głównych przy użyciu funkcji FindNeighbors. Następnie zastosowano algorytm louvaina do optymalizacji modularności za pomocą funkcji FindClusters. Parametry rozdzielczości klasteryzacji ustawiono w punkcie, w którym klastry wykazywały wysoce zróżnicowane profile transkrypcyjne. Klasteryzacja była niezależna od liczby genów wykrytych na komórkę (Supplementary Fig. 17b). Markerami specyficznymi dla klastra były geny ulegające różnej ekspresji dla każdego klastra zidentyfikowane za pomocą funkcji FindMarkers w programie Seurat przy następujących ustawieniach: min.pct = 0.3, logfc.threshold = 0.25, min.diff.pct = 0.15,test.use = „MAST”. Zidentyfikowane markery z dostosowanym P < 0,05 były używane do dalszej analizy. Ponieważ niektóre typy komórek, takie jak komórki mięśni gładkich i komórki muru, miały dobrze znane markery, ich pojawienie się na szczycie listy markerów dla każdego klastra potwierdziło nasze procesy selekcji markerów. Aby usunąć niepożądane źródła zmienności, takie jak płeć, komórki zostały rozdzielone na podstawie obecności transkryptu Xist specyficznego dla kobiet i zintegrowane. Aby przeprowadzić integrację różnych zbiorów danych, najpierw znormalizowaliśmy logarytmicznie każdą surową macierz ekspresji i zidentyfikowaliśmy 2000 najbardziej zmiennych genów dla każdego zbioru danych. Następnie, używając funkcji FindIntegrationAnchors w programie Seurat, zidentyfikowaliśmy punkty kotwiczenia między zbiorami danych. Następnie, zbiory danych zostały zintegrowane w oparciu o zidentyfikowane kotwice za pomocą funkcji IntegrateData programu Seurat. Zintegrowane zbiory danych zostały następnie przeskalowane, a wymiary zredukowane do dalszej analizy skupień. Klastry w zintegrowanych zbiorach danych zostały zanotowane przez ich profile ekspresji genów w zidentyfikowanych listach twórców.

Analiza wzbogacenia ontologii genów

Analizę wzbogacenia ontologii genów na markerach klastrów przeprowadzono przy użyciu pakietu R goseq (wersja 1.34.0)53. W zależności od długości genu uzyskano wagi dla każdego genu i zastosowano aproksymację Walleniusa do identyfikacji powiązanych terminów ontologii genowej. Wybrano terminy ontologii genów, które mają skorygowane P < 0,05 i kategorie procesów biologicznych.

Statystyka

Nie stosowano żadnych metod statystycznych w celu wstępnego określenia wielkości próby. Eksperymenty były randomizowane, a badacze byli zaślepieni na alokację podczas eksperymentów i analiz wyników. Wszystkie wartości są przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Istotność statystyczną określono za pomocą dwustronnego testu U Manna-Whitneya między dwiema grupami lub dwukierunkowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Holma-Sidaka dla porównania wielu grup. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.