1 Teoria
Oligonukleotydy są syntetyzowane przez dodanie jednej zasady na raz, rozciągając się od 3′ do 5′-końca, przymocowanej do podpory w fazie stałej. Kiedy synteza chemiczna oligonukleotydu jest zakończona, łańcuch DNA jest uwalniany ze stałego nośnika poprzez inkubację z wodorotlenkiem amonu. Amon działa również jako środek deprotekcyjny, odłączając grupy chroniące fosforany w wiązaniach fosfodiestrowych. Następnie dodaje się gorący amoniak w celu hydrolizy grup ochronnych z egzocyklicznych grup aminowych deoksyadenozyny, deoksycytozyny i deoksyguanozyny. Oligonukleotyd może być dostarczony użytkownikowi w roztworze amoniaku jako surowy preparat. W tym przypadku, przed użyciem, może być konieczne przeprowadzenie dodatkowego etapu w celu usunięcia soli i produktów ubocznych z preparatu oligonukleotydu powstałych podczas deprotekcji.
Po deprotekcji, preparat oligonukleotydu jest zwykle odsalany, kwantowany, odparowywany do sucha w liofilizatorze i dostarczany użytkownikowi w postaci proszku. Odsolony roztwór oligonukleotydu zawiera oligonukleotyd o pełnej długości, ale zawiera również mieszaninę produktów okrojonych, które zostały nagromadzone podczas syntezy chemicznej. Obcięcie występuje, gdy określona baza nie zdoła dodać się do łańcucha w odpowiednim cyklu (Hecker & Rill, 1998). Tak więc, procent produktów okrojonych zgromadzonych w preparacie zależy od wydajności syntezy (frakcja produktu o pełnej długości po syntezie) i długości cząsteczki. Długie oligonukleotydy, których synteza wymaga większej ilości cykli, są mniej czyste niż krótkie oligonukleotydy. Te braki mogą konkurować z produktem o pełnej długości w niektórych zastosowaniach i mogą wymagać usunięcia, zanim oligonukleotyd będzie mógł być użyty. Jednakże odsolone preparaty oligonukleotydów są zwykle odpowiednie do wielu zastosowań, takich jak standardowy PCR lub mikromacierze, zwłaszcza jeśli oligonukleotyd ma < 20 nukleotydów długości.
Dalsze oczyszczanie dla oligonukleotydów dłuższych niż 50 zasad jest zalecane, ponieważ procent produktu o pełnej długości w preparacie jest zwykle nie większy niż 80%. W przypadku wymagających zastosowań, w których ważna jest dokładna długość oligonukleotydu, takich jak testy żel-shift, mutageneza ukierunkowana miejscem wiązania, sekwencjonowanie, produkcja adapterów do klonowania lub synteza pierwszej nici cDNA w celu wytworzenia bibliotek, zalecane jest dodatkowe oczyszczanie, nawet w przypadku krótszych oligonukleotydów (patrz więcej informacji na temat technik powyżej Standardowe testy in vitro do oceny interakcji białko-kwas nukleinowy – testy żel-shift do oceny wiązania RNA i DNA oraz mutageneza ukierunkowana miejscem wiązania).
Puryfikacja może być wymagana po syntezie lub po enzymatycznej modyfikacji oligonukleotydu. Istnieje kilka metod umożliwiających osiągnięcie tego celu, a wybór zależy od charakteru oligonukleotydu i zastosowania, do którego jest przeznaczony.
Oczyszczanie metodą HPLC w fazie odwróconej opiera się na hydrofobowości. Wykorzystuje ona niepolarną fazę stacjonarną oraz wodne bufory i rozpuszczalniki organiczne jako fazę ruchomą do elucji analitów; związki polarne są eluowane w pierwszej kolejności, podczas gdy związki niepolarne są zatrzymywane. Jest to najlepsza metoda do oczyszczania oligonukleotydów modyfikowanych grupą hydrofobową, takich jak biotyna, etykiety barwników fluorescencyjnych lub koniugacje NHS-ester. Odzysk masy jest wyższy niż w przypadku oczyszczania metodą PAGE i pozwala na oczyszczanie większych ilości oligonukleotydów (skala mmolowa), chociaż nie usuwa tak efektywnie produktów niekompletnych. Wkłady do oczyszczania oligonukleotydów, oparte na chromatografii fazy odwróconej, zapewniają szybką metodę odsalania i oczyszczania oligonukleotydów.
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) powoduje rozdzielenie oligonukleotydów zgodnie z ich długością, a tym samym zapewnia rozdzielczość wystarczającą do odróżnienia produktów o pełnej długości od niekompletnych cząsteczek (Atkinson i Smith, 1984). Żele poliakrylamidowe są bardziej skuteczne w rozdzielaniu małych fragmentów DNA niż żele agarozowe (patrz Analiza RNA za pomocą analitycznej elektroforezy na żelu poliakrylamidowym i elektroforeza na żelu agarozowym). Jedyną wadą żeli poliakrylamidowych jest to, że są one trudniejsze do przygotowania i obróbki niż żele agarozowe. Żele poliakrylamidowe są prowadzone w konfiguracji pionowej w stałym polu elektrycznym. Po elektroforezie oligonukleotyd jest eluowany z żelu i zatężany przy użyciu precypitacji etanolem (więcej na temat precypitacji kwasów nukleinowych można znaleźć w dziale Oczyszczanie RNA – metody precypitacji) lub chromatografii fazy odwróconej. Jest to metoda z wyboru, gdy pożądany jest najwyższy procent oligonukleotydów o pełnej długości do wymagających zastosowań. Jest ona również zdecydowanie zalecana dla oligonukleotydów dłuższych niż 30 zasad. Ponadto, kilka próbek może być wykonywanych jednocześnie i nie jest wymagany drogi sprzęt. Jedyną wadą tej techniki jest niewielka ilość oligonukleotydu uzyskana podczas jednego oczyszczania. Zazwyczaj stosuje się oligonukleotydy w skali 1 μmol lub mniejszej, a odzysk masy po oczyszczaniu metodą PAGE wynosi < 50%, a w przypadku oligonukleotydów modyfikowanych jest jeszcze niższy. Niemniej jednak, chociaż wydajność jest niska, jest ona zadowalająca dla większości zastosowań biochemicznych.
Preparat oligonukleotydowy jest ładowany na denaturujący żel poliakrylamidowy w ilości co najmniej 1 mg na pas. Zakres rozdzielczości żelu zależy od stężenia poliakrylamidu. Dla krótkich oligonukleotydów (od 15 do 35 zasad) zalecane są żele poliakrylamidowe 13-15%; dla dłuższych oligonukleotydów (od 35 do 70 zasad) zalecane są żele poliakrylamidowe 8-13%. Procentowy udział żelu powinien być dostosowany do systemu prowadzenia. Do oczyszczania oligonukleotydów o długości 25 zasad używamy zwykle systemu Bio-Rad Mini Protean II i prowadzimy żele 15%. Po identyfikacji właściwego pasma za pomocą wizualizacji UV, pasmo jest wycinane i ekstrahowane z żelu.
Dwie różne metody oczyszczania oligonukleotydów z żeli poliakrylamidowych zostały opisane w tym rozdziale. Najprostszą metodą jest elucja za pomocą dyfuzji. Opiera się ona na ruchu cząsteczek z obszaru o wyższym stężeniu do obszaru o niższym stężeniu. Wynikiem dyfuzji jest stopniowe mieszanie się materiału. Metoda ta jest czasochłonna, ale nie wymaga zbyt dużego nakładu pracy ani żadnego sprzętu. Polega ona na tym, że pasmo poliakrylamidowe zawierające interesujący nas oligonukleotyd jest krojone na małe kawałki i pokrywane buforem elucyjnym. Po inkubacji, DNA jest oczyszczane z supernatantu przez wytrącenie etanolem. Wydajność jest ograniczona, pomiędzy 20% a 70%, w zależności od długości oligonukleotydu. Im większa ilość użytego buforu elucyjnego, tym więcej oligonukleotydu ulega dyfuzji z żelu.
Druga metoda to elektroelucja do worka dializacyjnego (McDonell i in., 1977). Fragment żelu zawierający oligonukleotyd jest wycinany i umieszczany w worku dializacyjnym z buforem. Przyłożenie prądu elektrycznego powoduje migrację DNA z żelu do buforu w worku dializacyjnym. Oligonukleotyd jest odzyskiwany z tego buforu i oczyszczany. Stosując tę metodę, oligonukleotyd może być izolowany z dobrą wydajnością, chociaż jest ona czasochłonna, jeśli duża liczba próbek jest oczyszczana w tym samym czasie, ponieważ wymaga ona umieszczenia każdego pasma żelu w indywidualnych workach dializacyjnych. Metoda ta sprawdza się również w przypadku większych fragmentów DNA i może być nawet stosowana do ekstrakcji DNA z żeli agarozowych.