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Das menschliche Y-Chromosom wird über den größten Teil seiner Länge direkt vom Vater auf den Sohn vererbt, was zu einem männerspezifischen Vererbungsmuster führt, das sich vom Rest des Genoms unterscheidet. Phänotypische Merkmale des Y-Chromosoms sollten daher leicht an der männlichen Vererbungslinie zu erkennen sein, und frühe Studien behaupteten, mehrere solcher Merkmale zu identifizieren, darunter bemerkenswerte Beispiele wie „haarige Ohren“. Eine kritische Prüfung dieser Behauptungen ergab jedoch bereits 1957, dass keines der 17 untersuchten Merkmale nachgewiesen werden konnte,1 was durch eine spätere molekulargenetische Analyse der „haarigen Ohren“ selbst bestätigt wurde.2 Dieses vielleicht überraschende Fehlen von Y-chromosomalen Merkmalen kann zumindest teilweise als Folge zweier Faktoren verstanden werden. Als 2003 eine Referenzsequenz für die männerspezifische Region des menschlichen Y-Chromosoms erstellt wurde,3 zeigte sich erstens, dass das Chromosom nur wenige männerspezifische Gene trägt und für nur 23 verschiedene Proteine kodiert. Spätere Arbeiten ergaben, dass drei dieser Gene bei etwa 2 % der südasiatischen Männer fehlen, deren Y-Chromosomen also für nur 20 männerspezifische Proteine kodieren.4 Zweitens hat das Y-Chromosom spezielle Funktionen bei der männlichen Geschlechtsbestimmung und Fruchtbarkeit, bei denen es unwahrscheinlich ist, dass eine mendelsche Variation vererbbar ist. So konnte man Anfang 2004 schreiben, dass „die Stammbaumanalyse noch kein einziges Y-gebundenes Gen ergeben hat“.5 Später im selben Jahr wurde jedoch eine Y-gebundene Hörbehinderung (DFNY1, MIM 400043) in einer chinesischen Familie6 gemeldet, die nach wie vor die einzige dokumentierte Mendelsche Störung ist, die eine Y-Verknüpfung beim Menschen aufweist. Die Grundlage dieser Störung scheint daher ungewöhnlich zu sein und ist von großem Interesse. Hier untersuchen wir diese Grundlage, indem wir die Sequenz des Y-Chromosoms von DFNY1 untersuchen und sie mit dem Y-Chromosom eines eng verwandten, aber nicht betroffenen Zweigs der Familie vergleichen.

In dem 2004 berichteten DFNY1-Stammbaum über sieben Generationen waren alle erwachsenen Männer betroffen.6 Anschließend wurde der Stammbaum um zwei weitere Generationen zurückverfolgt, und es wurden zusätzliche männliche Nachkommen eines früheren Vorfahren identifiziert.7 Auffallend ist, dass ihr Gehör nicht beeinträchtigt war (Abbildung 1). Wir hatten zuvor die Identität der Y-Chromosomen der beiden Zweige der Familie an 67 Y-STR-Loci nachgewiesen und folgerten daher, dass der phänotypische Unterschied zwischen den Zweigen mit einer genetischen Variante zusammenhängen muss, die speziell vom Y-Chromosom des betroffenen Zweigs getragen wird. Wir sortierten ein repräsentatives Y-Chromosom aus jedem Zweig mittels Durchflusszytometrie und sequenzierten es anschließend. Es wurden nur vier Basenunterschiede zwischen den Chromosomen festgestellt.8 Drei davon waren auf dem nicht betroffenen Zweig entstanden. Die vierte war auf dem betroffenen Zweig entstanden und segregierte mit dem Phänotyp, aber sie war ein schlechter Kandidat für die ursächliche Mutation, da sie außerhalb eines annotierten Gens lag. Obwohl bei dieser Analyse die wiederholten Regionen des Chromosoms nicht ausgewertet werden konnten, sind die bekannten wiederholten Gene hauptsächlich an der Spermatogenese beteiligt,3,9 so dass wir in der aktuellen Studie die Möglichkeit untersucht haben, dass es sich bei der ursächlichen Mutation möglicherweise nicht um eine Punktmutation handelt. Diese Studie wurde von den Probenspendern, die ihre schriftliche Einwilligung gegeben haben, und vom Ausschuss für medizinische Ethik des chinesischen PLA General Hospital, Peking, China, genehmigt.

Der DFNY1-Stammbaum

Männchen, Quadrate; Weibchen, Kreise; diagonale Linie, verstorben. Ausgefüllte Symbole weisen auf eine Hörbehinderung hin (auch aus Familienaufzeichnungen); Fragezeichen kennzeichnen zwei Individuen, deren Hörphänotyp unbekannt ist; und Sternchen kennzeichnen Individuen, die sich auf dem betroffenen Zweig befinden, aber zum Zeitpunkt der Untersuchung unter dem Alter des Auftretens der Symptome waren. Die Pfeile zeigen die beiden Personen an, deren Y-Chromosomen sequenziert wurden. Die strukturelle Umlagerung fand während einer der vier mit roten Sternen markierten Meiosen statt. Die Ehepartner sind in den Generationen VII-IX und in Generation VI auf dem nicht betroffenen Zweig weggelassen.

Wir untersuchten die relative Lesetiefe entlang des Chromosoms, indem wir hochwertige duplikatgefilterte Reads mit Hilfe des Sequence Search and Alignment by Hashing Algorithm 2 (SSAHA2)10 an der chrY-Referenzsequenz ausrichteten und die Anzahl der Reads pro 10 kb Bin zwischen den Y-Chromosomen des betroffenen Individuums VIII-2 (Abbildung 1) und des nicht betroffenen Individuums VII-24 (Abbildung 1) verglichen. Dies ergab drei diskontinuierliche Segmente, die im betroffenen Chromosom dupliziert waren, und alle stammten aus der begrenzten Region zwischen dem TSPY1 (MIM 480100) Gencluster, der bei ∼9,3 Mb endet, und der zentromerischen Lücke bei ∼10,1 Mb (Abbildung 2A). Diese Duplikationen wurden durch konventionelle Oligonukleotid-Array-Hybridisierung (CGH) mit einem 1-Millionen-Array von Agilent, der das gesamte Genom abdeckt, und einem kundenspezifischen NimbleGen 385K-Array bestätigt, der die Positionen chrY: 2.000.000-10.715.000 (1.990.000-10.105.000 hg19) bei hoher (∼20 bp) Auflösung abdeckt (Abbildung 2B). Da sie einen Teil des TSPY1-Genclusters umfassten, konnten wir eine Zunahme der TSPY1-Genzahl durch qPCR (Tabelle S1 in den ergänzenden Daten online verfügbar) und Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE; Abbildung S1) nachweisen. Diese Analysen zeigten, dass die Duplikation von allen betroffenen Familienmitgliedern geteilt wurde und bei allen nicht betroffenen Mitgliedern fehlte und dass die Duplikation in einem separaten Restriktionsfragment des ursprünglichen TSPY1-Clusters lag und somit nicht zusammenhängend war. Obwohl der kombinierte Nachweis eine komplexe Duplikation der 9,3-10,1 Mb großen Region bestätigte, lieferte er keine Informationen darüber, wo die duplizierten Sequenzen eingefügt wurden. Die Metaphasen-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit einer TSPY1-Sonde zeigte ein einzelnes Signal (nicht gezeigt), so dass wir für eine höhere Auflösung Faser-FISH wie zuvor beschrieben11 verwendeten. Y-chromosomale Sonden waren BAC-Klone, die den größten Teil von ∼9,3-10,1 Mb der Referenzsequenz abdeckten: RP11-334D2 (einschließlich TSPY1), RP11-182H20, RP11-155J5, RP11-160K17 und RP11-108I14 (einschließlich zentromerischer Sequenzen). Die Ergebnisse (Abbildung 2C) zeigen, dass das nicht betroffene Chromosom in der gleichen Weise wie die Referenzsequenz organisiert ist, die als TSPY1-182H20-Zentromer zusammengefasst werden kann. Im Gegensatz dazu war das betroffene Chromosom (Abbildung 2D) innerhalb der 182H20-Sequenz unterbrochen, so dass die Organisation TSPY1-partielle 182H20-Lücke-zentrromerische Duplikation-TSPY1-Duplikation-182H20-Zentromer entstand. Die Faser-FISH-Ergebnisse zeigten somit, dass die duplizierten Y-Sequenzen lokal in einer neu angeordneten Form wieder eingefügt wurden, aber sie offenbarten auch das Vorhandensein eines Segments, das mit keiner Sonde aus der TSPY1-Zentromerregion hybridisierte.

Charakterisierung der strukturellen Umstrukturierung, die vom DFNY1-Y-Chromosom getragen wird

(A) Relative Lesetiefe (betroffen/unbetroffen) in 10-kb-Bins, die der Y-Chromosom-Referenzsequenz zwischen 9,3 und 10,1 Mb zugeordnet sind.

(B) CGH log2 ratio (affected/unaffected) für dieselbe Region.

(C) Fiber-FISH der drei BAC-Klone, die dem nicht betroffenen Y-Chromosom zugeordnet sind, was zeigt, dass es die Referenzstruktur in dieser Region trägt. Sowohl 334D2 als auch 108I14 weisen Tandem-Arrays auf, die größer sind als die Größe des BAC-Klons.

(D) Fiber-FISH der gleichen BAC-Klone mit dem betroffenen Y-Chromosom. Dieses Chromosom trägt eine Insertion, die die 182H20-hybridisierende Region unterbricht und partielle Duplikationen sowohl der 334D2- als auch der 108I14-hybridisierenden Sequenzen enthält.

(E) Absolute Lesetiefe von nicht betroffenen und betroffenen Y-Chromosomen zu der 160.15-160,35 Mb der Chromosom-1-Referenzsequenz.

(F) CGH log2-Verhältnis (betroffen/unbetroffen) für dieselbe Chromosom-1-Region.

(G) Metaphasen-FISH des Chromosom-1-BAC-Klons 179G5 auf dem nicht-betroffenen Y-Chromosom (gelb). Die Hybridisierung ist nur an der Referenzstelle auf Chromosom 1 zu sehen.

(H) Metaphasen-FISH der gleichen Chromosom-1-Sonde auf dem betroffenen Y-Chromosom (gelb). Hybridisierung ist an einem zusätzlichen Locus auf dem Y-Chromosom zu sehen.

(I) Fiber-FISH der beiden angegebenen Y-BAC-Klone sowie der Chromosom-1-Klone 574F21, 179G5 und 1365F20 auf dem nicht betroffenen Y-Chromosom. Es wird kein Chromosom-1-Signal auf dem Y nachgewiesen.

(J) Fiber-FISH der gleichen Klone mit dem nicht betroffenen Y-Chromosom. Die Chromosom-1-Klone weisen ein Signal auf dem Y zwischen dem partiellen 182H20-Signal und dem 108I14-Signal auf. Die Genomkoordinaten beziehen sich auf GRCh37/hg19.

Um diese unbekannten Sequenzen zu identifizieren, führten wir eine thermische asymmetrische verschachtelte PCR (TAIL-PCR)12 an dem Segment durch, das sich vom 182H20-Bruchpunkt in die Lücke hinein erstreckt, und verwendeten dazu die in Tabelle S2 aufgeführten Primer. Bei diesem Verfahren werden in aufeinanderfolgenden Amplifikationen verschachtelte Primer, die für die bekannte Sequenz spezifisch sind, mit degenerierten Primern gepaart, von denen erwartet wird, dass sie in der unbekannten flankierenden Sequenz primen. Die potentiellen Kreuzungsprodukte werden erkannt, da ihre Größenunterschiede in aufeinanderfolgenden Reaktionen die bekannten Primerpositionen widerspiegeln. Die benachbarten Sequenzen, die mit bruchpunktspezifischen Primern bestätigt wurden (Tabelle S3 und Abbildungen S2 und S3), stammten von Chromosom 1 (160,16 Mb), und die Untersuchung der Lesetiefe, der CGH-Profile (Abbildungen 2E und 2F) und der Sequenz deutete auf die Beteiligung einer zusammenhängenden Region von ∼160 kb hin; diese Beteiligung wurde durch die Identifizierung einer zweiten, komplexeren Chromosom-1-Y-Kreuzung bei 160,32 Mb unterstützt. Die Translokation von Chromosom-1-Sequenzen auf das betroffene Y wurde durch Metaphasen-FISH (Abbildungen 2G und 2H) bestätigt, und ihre Lage innerhalb der Lücke in der Y-Duplikation wurde durch Faser-FISH (Abbildungen 2I und 2J) mit BACs RP11-574F21, RP11-179G5 und W12-1365F20 von Chromosom 1 als Sonden bestätigt. Die kombinierten Daten zeigten somit eine komplexe Duplikationsstruktur, die sowohl aus einem Fragment von Chromosom 1 als auch aus mehreren Segmenten der Y-DNA besteht (Tabelle S4 und Abbildungen S2 und S3). Keiner der sequenzierten Bruchpunkte wies große Längen an Homologie auf, aber alle zeigten Mikrohomologie, ein Muster, das auf FoSTeS (fork stalling and template switching) hinweist, einen Mechanismus, der disparate Genomfragmente während der Replikation kombiniert.13

Die hier beobachtete duplizierte Struktur wurde bisher nirgendwo anders berichtet und muss während einer von nur vier Meiosen entstanden sein, die die Meiose umfassen, in der die DFNY1-Mutation selbst auftrat (Abbildung 1). Es ist daher wahrscheinlich, dass sie kausal ist. Die duplizierten Y-chromosomalen Sequenzen kodieren nur für ein bekanntes Protein, TSPY1, aus einem Tandem-Array von ∼10 TSPY1-Genen, während die Chromosom-1-Sequenzen fünf RefSeq-Gene (CASQ1 , PEA15 , DCAF8 , PEX19 und COPA ) und das 5′-Ende eines anderen Gens, NCSTN (MIM 605254) (Exons 1-3; Abbildung 3), enthalten. Zu den Mechanismen, durch die die Duplikation zum Phänotyp der Taubheit führen könnte, gehören eine Erhöhung der Genkopienzahl, eine unangemessene Expression aufgrund einer neuen flankierenden DNA oder die Bildung eines veränderten Produkts durch Trunkierung, Fusion oder Punktmutation. Von der DFNY1-Familie liegen keine Expressionsdaten vor, und in den RefSeq-Genen auf Chromosom 1 wurden keine nicht-synonymen Mutationen gefunden (Tabelle S5). Die TSPY1-Kopienzahl ist in der Bevölkerung polymorph14 , und eine höhere Anzahl von TSPY1-Kopien wurde auch bei 47,XYY-Personen gefunden, ohne dass Taubheit festgestellt wurde; eine Studie brachte eine hohe TSPY1-Kopienzahl mit einem anderen Phänotyp, nämlich Unfruchtbarkeit, in Verbindung.15 Eine erhöhte TSPY1-Kopienzahl ist daher ein schlechter Kandidat für Taubheit. Im Gegensatz dazu liegt die Region von Chromosom 1 vollständig innerhalb eines etwa 900 kb großen Intervalls, DFNA49 (MIM %608372), das früher mit Hörverlust in Verbindung gebracht wurde; die ursächliche Mutation in diesem Intervall ist nach wie vor unbekannt.16 Wir schlagen daher vor, dass dasselbe Gen oder dieselben Gene sowohl dem Phänotyp DFNA49 als auch dem Phänotyp DFNY1 zugrunde liegen könnten. Der plausibelste Mechanismus wäre die Dosisempfindlichkeit eines oder mehrerer dieser Gene, so dass eine erhöhte Expression bei drei Kopien zu Hörverlust führt, obwohl andere Mechanismen nicht ausgeschlossen sind.

Struktur und Geninhalt der nicht betroffenen und betroffenen Y-Chromosomen

(A) Die Struktur des nicht betroffenen (VII-24 in Abbildung 1) Y-Chromosoms. Grau und schwarz: Fehler bzw. Lücken in der GRCH37-Assembly. Blau: Region, die mit der Referenzsequenz auf dem verwendeten Auflösungsniveau übereinstimmt. Darunter sind ein Teil des TSPY1-Arrays (blaue Pfeilspitzen) und die Lage der in Abbildung 2 identifizierten BAC-Klonsignale dargestellt.

(B) Struktur des betroffenen (VIII-2 in Abbildung 1) Y-Chromosoms. Dieses Chromosom enthält ein Segment, das im nicht betroffenen Chromosom nicht vorhanden ist; dieses Segment ist aus Duplikationen von Sequenzen sowohl von Chromosom 1 (gelb) als auch vom Y-Chromosom (blau) entstanden. Auch hier sind die Geninhalte und BAC-Signale unten dargestellt. Die Pfeilspitzen oben zeigen die Ausrichtung der duplizierten Segmente relativ zur Referenzsequenz an.

(C) Detailansicht der beiden Chromosom 1-Y-Verbindungen, die auf Sequenzebene untersucht wurden (Abbildungen S2 und S3), und die den Unterschied zwischen der einfachen Struktur von Verbindung 1 und der komplexen Struktur von Verbindung 2 zeigen.

Wir fanden heraus, dass die Ursache der menschlichen Y-gebundenen Mendelschen Störung eher mit der Einfügung von Chromosom-1-Sequenzen als mit der Mutation eines Y-chromosomalen Gens verbunden ist. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass weder eine Duplikation (47,XYY-Karyotyp) noch eine Deletion (45,X-Karyotyp) des gesamten Y-Chromosoms und damit aller seiner Gene mit einer Hörstörung einhergeht, was bedeutet, dass ein Funktionsverlust oder eine Duplikation eines Y-chromosomalen Gens dem DFNY1-Phänotyp wahrscheinlich nicht zugrunde liegt. Die Komplexität des Rearrangements steht auch im Einklang mit seiner Seltenheit: Obwohl Taubheit bei Männern ein leicht erkennbarer Phänotyp sein sollte, wurde unseres Wissens nur über eine einzige weitere Familie mit einem ähnlichen Phänotyp berichtet.17 Die Verwandtschaft zwischen den beiden Familien ist unbekannt; die zweite Familie ist ebenfalls chinesisch, gehört aber einer anderen ethnischen Gruppe an (Tujia statt Han). Die audiologischen Merkmale sind jedoch ähnlich, und auf der Grundlage des derzeitigen Wissensstandes ist es unmöglich, einen gemeinsamen Ursprung auszuschließen. Trotz der Seltenheit dieses spezifischen Rearrangements betrachten wir die Übernahme autosomaler Sequenzen durch das Y-Chromosom als normalen Teil der Y-chromosomalen Evolution, der in der Regel neutral ist und gelegentlich eine Fixierung erreicht, obwohl er im Fall von DFNY1 nachteilig ist. In der Tat ist es bemerkenswert, dass das Y-Chromosom eine fixe Insertion von ∼100 kb aus der chromosomalen Region 1q43 im proximalen Yq,18 nahe der DFNY1-Insertion trägt. Diese Beobachtung wirft die Frage auf, ob die Nähe im Zellkern den DNA-Transfer zwischen diesen beiden Chromosomen begünstigen könnte.19 Der vorgeschlagene DFNY1-Mutationsmechanismus, FoSTeS, wurde bisher nur mit intrachromosomalen Rearrangements in Verbindung gebracht,13 so dass die aktuelle Studie seinen Einfluss auf interchromosomale Rearrangements ausweitet; sie unterstreicht auch die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der vernachlässigten Beziehung zwischen Kopienzahlvariation und Hörschädigung.20