Înainte de disponibilitatea calculatoarelor, determinarea valorilor KM și Vmax necesita manipularea algebrică a ecuației de bază Michaelis-Menten. Deoarece Vmax se apropie asimptotic de Vmax (a se vedea figura 8.11), este imposibil să se obțină o valoare definitivă dintr-un grafic Michaelis-Menten tipic. Deoarece KM este concentrația de substrat la Vmax/2, este, de asemenea, imposibil să se determine o valoare exactă a lui KM. Cu toate acestea, Vmax poate fi determinat cu exactitate dacă ecuația Michaelis-Menten este transformată într-o ecuație care să dea un traseu liniar. Luând reciproca ambelor părți ale ecuației 23 se obține
Un grafic al lui 1/V0 în funcție de 1/, numit grafic Lineweaver-Burk sau grafic dublu-reciproc, dă o linie dreaptă cu o intercepție de 1/Vmax și o pantă de KM/Vmax (figura 8.36). Interceptarea pe axa x este -1/KM.
Figura 8.36
Un grafic dublu-reciproc sau Lineweaver-Burk. O diagramă dublu-reciprocă a cineticii enzimatice este generată prin reprezentarea grafică a 1/V0 în funcție de 1/. Panta este KM/Vmax, intercepția de pe axa verticală este 1/Vmax, iar intercepția de pe axa orizontală (mai mult…)
.
Plogramele dublu-reciproce sunt deosebit de utile pentru a distinge între inhibitori competitivi și necompetitivi. În cazul inhibiției competitive, intercepția de pe axa y a graficului 1/V0 versus 1/ este aceeași în prezența și în absența inhibitorului, deși panta este crescută (figura 8.37). Faptul că intercepția este neschimbată se datorează faptului că un inhibitor competitiv nu modifică Vmax. La o concentrație suficient de mare, practic toate situsurile active sunt ocupate de substrat, iar enzima este pe deplin operativă. Creșterea pantei graficului 1/V0 versus 1/ indică puterea de legare a inhibitorului competitiv. În prezența unui inhibitor competitiv, ecuația 31 este înlocuită cu
în care este concentrația inhibitorului și Ki este constanta de disociere a complexului enzimă-inhibitor.
Figura 8.37
Inhibiția competitivă ilustrată pe o diagramă dublu-reciprocă. O diagramă dublu-reciprocă a cineticii enzimei în prezența (
)și absența (
) unui inhibitor competitiv ilustrează faptul că inhibitorul nu are niciun efect asupra Vmax, dar crește KM.
În alte cuvinte, panta graficului este mărită de factorul (1 + /Ki) în prezența unui inhibitor competitiv. Luați în considerare o enzimă cu o KM de 10-4 M. În absența inhibitorului, V0 = Vmax/2 când = 10-4 M. În prezența unui inhibitor competitiv de 2 × 10-3 M care este legat de enzimă cu un Ki de 10-3 M, KM aparentă (KappM ) va fi egală cu KM × (1 + /Ki), sau 3 × 10-4 M. Înlocuind aceste valori în ecuația 23 se obține V0 = Vmax/4, când = 10-4 M. Prezența inhibitorului competitiv reduce astfel viteza de reacție la jumătate la această concentrație de substrat.
În inhibiția necompetitivă (figura 8.38), inhibitorul se poate combina fie cu enzima, fie cu complexul enzimă-substrat. În inhibiția necompetitivă pură, valorile constantelor de disociere ale inhibitorului și ale enzimei și ale inhibitorului și ale complexului enzimă-substrat sunt egale (secțiunea 8.5.1). Valoarea Vmax este redusă la o nouă valoare numită Vappmax și, prin urmare, intercepția de pe axa verticală este mărită. Noua pantă, care este egală cu KM/Vappmax, este mai mare cu același factor. Spre deosebire de Vmax, KM nu este afectată de inhibiția pur necompetitivă. Viteza maximă în prezența unui inhibitor necompetitiv pur, Vimax, este dată de
Figura 8.38
Inhibiția necompetitivă ilustrată pe o diagramă dublu-reciprocă. O diagramă dublu-reciprocală a cineticii enzimei în prezența (
) și absența (
) unui inhibitor necompetitiv arată că KM nu se modifică și Vmax este diminuat.