1 Teorie
Oligonucleotidele sunt sintetizate prin adăugarea unei baze pe rând, care se extinde de la capătul 3′ la capătul 5′, atașată unui suport în fază solidă. Când sinteza chimică a oligonucleotidului este completă, lanțul de ADN este eliberat de pe suportul solid prin incubare cu hidroxid de amoniu. Amoniul acționează, de asemenea, ca un agent deprotector, eliminând grupurile care protejează fosfații din legăturile fosfodiesterice. După aceasta, se adaugă amoniac fierbinte pentru a hidroliza grupările protectoare de pe grupările amino exociclice ale deoxiadenozinei, deoxi-citosinei și deoxiguanosinei. Oligonucleotidul ar putea fi furnizat utilizatorului în soluția de amoniac sub formă de preparat brut. În acest caz, înainte de utilizare, poate fi necesar să se efectueze o etapă suplimentară pentru a elimina sărurile și subprodusele din preparatul de oligonucleotide generate în timpul deprotecției.
După deprotecție, preparatul de oligonucleotide este de obicei desalinizat, cuantificat, evaporat până la uscare într-un liofilizator și furnizat utilizatorului sub formă de pulbere. Soluția de oligonucleotide desalinizată conține oligonucleotida de lungime completă, dar conține și un amestec de produse trunchiate care s-au acumulat în timpul sintezei chimice. Trunchierea apare atunci când baza specificată nu reușește să se adauge la lanț în ciclul corespunzător (Hecker & Rill, 1998). Astfel, procentul de produse trunchiate acumulate în preparat este determinat de eficiența sintezei (fracțiunea de produs de lungime completă după sinteză) și de lungimea moleculei. Oligonucleotidele lungi, care necesită mai multe cicluri pentru a fi sintetizate, sunt mai puțin pure decât oligonucleotidele scurte. Aceste eșecuri pot concura cu produsul de lungime completă în unele aplicații și pot necesita îndepărtarea înainte ca oligonucleotidul să poată fi utilizat. Cu toate acestea, preparatele de oligonucleotide desalinizate sunt, de obicei, adecvate pentru multe aplicații, cum ar fi PCR standard sau microarrays, în special dacă oligonucleotidul are < 20 de nucleotide.
Se recomandă o purificare suplimentară pentru oligonucleotidele mai lungi de 50 de baze, deoarece procentul de produs de lungime completă în preparat nu este, de obicei, mai mare de 80%. Pentru aplicațiile solicitante în care lungimea exactă a oligonucleotidului este importantă, cum ar fi testele de deplasare pe gel, mutageneza dirijată pe situs, secvențierea, producerea de adaptoare de clonare sau sinteza ADNc pe primul șir pentru generarea de biblioteci, se recomandă o purificare suplimentară, chiar și pentru oligonucleotide mai scurte (a se vedea mai multe informații despre tehnicile de mai sus privind testele standard in vitro pentru interacțiunile proteină-acid nucleic – testele de deplasare pe gel pentru legarea de ARN și ADN și mutageneza dirijată pe situs).
Purificarea poate fi necesară după sinteză sau după modificarea enzimatică a oligonucleotidului. Există mai multe metode pentru a realiza acest lucru, iar alegerea depinde de natura oligonucleotidului și de aplicația căreia îi este destinat.
Purificarea HPLC în fază inversă se bazează pe hidrofobicitate. Aceasta utilizează o fază staționară nepolară și tampoane apoase și solvenți organici ca fază mobilă pentru a elua analiții; compușii polari sunt eluzionați mai întâi, în timp ce compușii nepolari sunt reținuți. Aceasta este cea mai bună metodă pentru purificarea oligonucleotidelor modificate cu o grupare hidrofobă, cum ar fi biotina, markerii cu coloranți fluorescenți sau conjugările NHS-ester. Recuperarea masei este mai mare decât atunci când se utilizează purificarea PAGE și se pretează la purificarea unor cantități mai mari de oligonucleotide (la scară mmole), deși nu elimină atât de eficient produsele incomplete. Cartușele de purificare a oligonucleotidelor, bazate pe cromatografia în fază inversă, oferă o metodă rapidă de desalinizare și purificare a oligonucleotidelor.
Electroforeza pe gel de poliacrilamidă (PAGE) rezolvă oligonucleotidele în funcție de lungimea lor și oferă astfel o rezoluție suficientă pentru a diferenția produsele de lungime completă de moleculele eșuate (Atkinson și Smith, 1984). Gelurile de poliacrilamidă sunt mai eficiente pentru separarea fragmentelor mici de ADN decât gelurile de agaroză (a se vedea Analiza ARN-ului prin electroforeză analitică pe gel de poliacrilamidă și Electroforeza pe gel de agaroză). Singurul dezavantaj al gelurilor de poliacrilamidă este că sunt mai dificil de preparat și de manipulat decât gelurile de agaroză. Gelurile de poliacrilamidă se rulează în configurație verticală într-un câmp electric constant. După electroforeză, oligonucleotidul este eluat de pe gel și concentrat, folosind precipitarea cu etanol (găsiți mai multe informații despre precipitarea acizilor nucleici la purificarea ARN – metode de precipitare) sau cromatografia în fază inversă. Aceasta este metoda de alegere atunci când se dorește un procent cât mai mare de oligonucleotide de lungime completă pentru aplicații solicitante. De asemenea, este puternic recomandată pentru oligonucleotide mai lungi de 30 de baze. De asemenea, pot fi analizate simultan mai multe probe și nu este nevoie de echipamente costisitoare. Singurul dezavantaj al acestei tehnici este cantitatea mică de oligonucleotide obținută la fiecare purificare. În mod obișnuit, oligonucleotidele sunt utilizate la scară de 1 μmol sau mai puțin, iar recuperarea masei după purificarea PAGE este de < 50% și chiar mai mică în cazul oligonucleotidelor modificate. Cu toate acestea, deși randamentul este scăzut, este satisfăcător pentru majoritatea aplicațiilor biochimice.
Preparatul de oligonucleotide se încarcă pe un gel de poliacrilamidă denaturantă într-o cantitate de cel puțin 1 mg pe culoar. Intervalul de rezoluție al gelului depinde de concentrația de poliacrilamidă. Pentru oligonucleotide scurte (de la 15 la 35 de baze), se recomandă geluri de poliacrilamidă de 13-15%; pentru oligonucleotide mai lungi (de la 35 la 70 de baze), se recomandă geluri de poliacrilamidă de 8-13%. Procentul de gel trebuie adaptat la sistemul de funcționare. Noi folosim de obicei sistemul Bio-Rad Mini Protean II și rulăm geluri de 15% pentru a purifica oligonucleotide cu o lungime de 25 de baze. După identificarea benzii corecte prin vizualizare UV, banda este excizată și extrasă de pe gel.
În acest capitol sunt descrise două metode diferite de purificare a oligonucleotidelor de pe geluri de poliacrilamidă. Cea mai simplă metodă este eluția prin difuzie. Aceasta se bazează pe mișcarea moleculelor dintr-o regiune cu o concentrație mai mare către una cu o concentrație mai mică. Rezultatul difuziei este o amestecare treptată a materialului. Această metodă este consumatoare de timp, dar nu necesită prea multă muncă sau vreun echipament. Practic, banda de poliacrilamidă care conține oligonucleotida de interes este tăiată în bucăți mici și acoperită cu tampon de eluție. După incubare, ADN-ul este purificat din supernatant prin precipitare cu etanol. Randamentul este limitat, între 20% și 70%, în funcție de lungimea oligonucleotidului. Cu cât se folosește o cantitate mai mare de tampon de eluție, cu atât mai mult oligonucleotid este difuzat din gel.
A doua metodă este electroeluția într-un sac de dializă (McDonell et al., 1977). Bucata de gel care conține oligonucleotidul este extirpată și plasată într-un sac de dializă cu un tampon. Aplicarea unui curent electric face ca ADN-ul să migreze din gel în tamponul din punga de dializă. Oligonucleotidul este recuperat din acest tampon și purificat. Utilizând această metodă, oligonucleotida poate fi izolată cu un randament bun, deși necesită mult timp în cazul în care se purifică un număr mare de probe în același timp, deoarece necesită introducerea fiecărei benzi de gel în saci de dializă individuali. De asemenea, această metodă funcționează bine pentru fragmente de ADN mai mari și poate fi utilizată chiar și pentru a extrage ADN din geluri de agaroză.
.