Subseturi distincte de fibroblaste reglează integritatea lacteală prin intermediul VEGF-C indus de YAP/TAZ în vilozitățile intestinale

Animale experimentale

Toată îngrijirea animalelor și procedurile experimentale au fost conforme cu toate reglementările etice pentru cercetarea și testarea pe animale, cu aprobarea Comitetului instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (nr. KA2016-12) al Institutului avansat de știință și tehnologie din Coreea (KAIST). Șoarecii Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 și Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 au fost transferați, stabiliți și crescuți în instalații pentru animale fără agenți patogeni specifici (SPF) la KAIST. Șoarecii C57BL/6 J, R26-tdTomato și Myh11-Cre-ERT2 au fost achiziționați de la Jackson Laboratory. Toți șoarecii au fost menținuți în fondul C57BL/6 și au fost hrăniți cu acces liber la o dietă standard (PMI LabDiet) și apă. Pentru a induce activitatea Cre la șoarecii Cre-ERT2, 2 mg de tamoxifen (Sigma-Aldrich) dizolvat în ulei de porumb (Sigma-Aldrich) a fost injectat intraperitoneal (i.p.) la punctele de timp indicate pentru fiecare experiment. Șoarecii Cre-ERT2 negativi, dar flox/flox-pozitivi din rândul colegilor de patrie au fost definiți ca șoareci de control (WT) pentru fiecare experiment. Șoarecii au fost anesteziați cu injectarea i.p. a unei combinații de anestezice (80 mg/kg de ketamină și 12 mg/kg de xilazină) înainte de a fi sacrificați.

Analize histologice

Pentru colorarea intestinului subțire la montură întreagă, după anestezie s-a efectuat o perfuzie transcardială cu paraformaldehidă (PFA) 2%. Intestinul subțire a fost recoltat și tăiat longitudinal pentru a expune lumenul. După mai multe spălări cu PBS, intestinele au fost fixate pe plăci de silicon. Probele au fost apoi post-fixate la 4 °C în PFA 4% timp de 2 ore. Probele au fost spălate cu PBS de mai multe ori și au fost ulterior deshidratate cu 10% zaharoză în PBS timp de 2 ore și cu 20% zaharoză, 10% glicerol în PBS peste noapte. Pielea urechii, traheea și diafragma au fost recoltate fără perfuzie transcardială și fixate în PFA 4% timp de 1 oră la 4 °C. Probele au fost spălate cu PBS de mai multe ori înainte de blocare. După blocarea cu 5% ser de capră sau de măgar în 0,5% Triton-X 100 în PBS (PBST) timp de 1 oră, probele au fost incubate cu anticorpii primari indicați, diluați în soluția de blocare la 4 °C peste noapte. După mai multe spălări cu PBST, probele au fost incubate timp de 2 ore la temperatura camerei (RT) cu anticorpii secundari conjugați cu fluorocromul indicat, diluați în tamponul de blocare. Probele au fost spălate cu PBST și nucleii au fost colorați cu DAPI (Invitrogen). După spălarea cu PBS, probele au fost montate cu Vecta-shield (Vector Laboratories). Imaginile au fost obținute cu ajutorul microscopului confocal Zeiss LSM 800 sau LSM 880 (Carl Zeiss).

Au fost utilizați următorii anticorpi primari și secundari în imunomarcaj: anti-LYVE-1 (policlonal de iepure, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (monoclonal de șobolan, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (monoclonal de hamster, MAB1398Z, Merck, 1: 400); anti-E-cadherină (policlonal de capră, AF748, R&D, 1: 200); anti-Prox1 (policlonal de capră, AF2727, R&D, 1:400); anti-Prox1 (policlonal de iepure, 102-PA32AG, ReliaTech, 1: 400); anti-VE-cadherină (policlonal de capră, AF1002, R&D, 1: 200); anti-PDGFRβ (monoclonal de șobolan, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (monoclonal de șoarece, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (policlonal de capră, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (monoclonal de iepure, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (policlonal de iepure, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (policlonal de iepure, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (policlonal de iepure, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (policlonal de capră, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (policlonal de iepure, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (policlonal de capră, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (monoclonal de iepure, 14074, Cell signaling, 1: 200); anti-TAZ (policlonal de iepure, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1: 200); anti-αSMA, conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) (monoclonal de șoarece, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (policlonal de capră, AF743, RD, 1:200); anti-VEGFR2 (policlonal de capră, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (monoclonal de iepure, 13179, Cell signaling, 1:400); anti-F4/80, conjugat cu FITC (monoclonal de șobolan, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (monoclonal de hamster, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmin (policlonal de iepure, AB907, Millipore, 1:400); și anticorpii secundari anti-rabie, anti-rabie, anti-șobolan, anti-șobolan, anti-capră, anti-șobolan conjugați cu Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647 (diluați la un raport de 1:1000) au fost achiziționați de la Jackson ImmunoResearch. Toți anticorpii utilizați în studiul nostru au fost validați pentru speciile și aplicațiile respective.

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH)

Pentru smFISH a intestinului subțire, s-a efectuat o perfuzie transcardială cu 2% PFA după anestezie. Probele au fost post-fixate la 4 °C în PFA 4% timp de 2 h. Probele au fost spălate cu PBS de mai multe ori, mutate în sucroză 30% și incubate peste noapte. Probele încorporate în OCT au fost secționate și am efectuat smFISH în conformitate cu protocolul producătorului care este descris în kitul RNAscope Fluorescent Multiplex Assay (320850, ACDBio). Sonda RNAcope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) a fost utilizată pentru smFISH. Următorii anticorpi primari și secundari au fost folosiți în imunomarcajul cu smFISH: anti-PDGFRβ (monoclonal de șobolan, ab91066, Abcam); anti-Shisa3 (policlonal de iepure, TA320118, Origene); anti-P2X1 (policlonal de iepure, APR-001, Alomone labs) și anticorpii secundari conjugați cu Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647- au fost achiziționați de la Jackson ImmunoResearch. Imaginile au fost obținute cu ajutorul microscopului confocal Zeiss LSM 800 sau LSM 880 (Carl Zeiss).

Sensul de încorporare a EdU pentru LEC-uri proliferante

Pentru a detecta LEC-uri proliferante în lactee, 5 mg de 5-etil-2′-deoxiuridină (EdU, A10044, Invitrogen) au fost dizolvate în 1 ml de apă Milli-Q ca soluție stoc. Apoi, 200 μl din soluția stoc pentru fiecare șoarece au fost injectați i.p. o dată la două zile timp de o săptămână înainte de analiză. Intestinul subțire a fost izolat și prelucrat conform descrierii de mai sus. Celulele încorporate cu EdU au fost detectate cu kitul Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) în conformitate cu protocolul producătorului.

Microscopie electronică

Pentru a capta imagini de microscopie electronică ultrastructurală a lacteului, intestinul subțire a fost secționat după perfuzie transcardială cu 4% PFA și 0,25% glutaraldehidă în tampon fosfat 0,1 M (pH 7,4). Probele au fost apoi fixate peste noapte în glutaraldehidă de 2,5 %, post-fixate cu tetroxid de osmiu 1% și deshidratate cu o serie de concentrații crescânde de etanol, urmate de încorporarea în rășină. Cu ajutorul unui ultramicrotom (UltraCut-UCT, Leica) s-au obținut secțiuni lacteale ultrasubțiri de 70 nm, care au fost apoi colectate pe grile de cupru. Probele au fost imaginate cu EM prin transmisie (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) la 120 kV, după colorarea cu acetat de uranil 2% și citrat de plumb.

Imagistica intravitală a eliminării lipidelor din lamina propria

Soarecii au fost anesteziați în urma îndepărtării alimentelor timp de 12 h înainte de procedură. Imagistica intravitală a fost realizată așa cum am descris anterior34. Pe scurt, sondele lipidice BODIPY (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) au fost dizolvate în soluție de DMSO 2,5% (Sigma-Aldrich). Anti-LYVE-1 (monoclonal de șobolan, 223322, RD) conjugat cu anticorpul Alexa Fluor 647 (Invitrogen) (0,75 mg/kg) a fost injectat intravenos la 12 h înainte de imagistică pentru marcarea fluorescentă a lactealelor. Apoi, jejunul proximal a fost exteriorizat într-o cameră de imagistică în care temperatura a fost menținută la 37 °C în timpul imagisticii. După deschiderea chirurgicală a lumenului intestinal cu 1,5 cm de-a lungul frontierei antimesenterice, pe lumenul expus a fost plasat un capac de sticlă pentru a obține o vedere a vilozităților. Imagistica intravitală a fost realizată pe parcursul a trei sesiuni. Vilozitățile au fost imaginate mai întâi înainte de alimentarea cu BODIPY-FA la 0 min. Apoi, 30 μl de sonde lipidice BODIPY au fost furnizate o dată înainte de a doua sesiune de imagistică pentru a observa absorbția inițială a lipidelor BODIPY la 1 min. Apoi, lipidele BODIPY au fost furnizate de trei ori la intervale de 2 min înainte de cea de-a treia sesiune de imagistică la 26 min, iar eliminarea BODIPY-FA prin lactee a fost analizată la 36 min și 46 min. S-a utilizat un microscop confocal cu scanare laser cu rată video construit în casă34. Două lasere cu undă continuă care emit la 488 nm (MLD, Coherent) și 640 nm (Cube, Coherent) au fost utilizate ca surse de excitație pentru imagistica de fluorescență. Două filtre trece-banda (FF01-525/50 și FF01-685/40, Semrock) au fost utilizate pentru detectarea semnalelor fluorescente. Rezoluția axială sub 4 μm a fost dobândită cu un orificiu de 100 μm și o lentilă de obiectiv 60x (LUMFLN, imersie în apă, NA 1,1, Olympus). Imaginile (512 × 512 pixeli) au fost obținute la o frecvență a cadrelor de 30 Hz. Pentru îmbunătățirea raportului semnal-zgomot al imaginii, zgomotul pe 90 de cadre după postprocesarea imaginilor în timp real (30 de cadre/sec) a fost mediatizat prin eliminarea artefactului de mișcare generat de peristaltism cu un program MATLAB scris la comandă. Software-ul ImageJ (NIH) a fost utilizat pentru măsurarea intensității fluorescente medii în lamina propria.

Test de absorbție a lipidelor

După eliminarea alimentelor timp de 12 h, 200 μl de ulei de măsline (Sigma-Aldrich) au fost administrați prin gavare orală pentru măsurarea trigliceridelor plasmatice și colorarea cu Oil Red O. Sângele a fost prelevat prin vena cozii în tubul de colectare a sângelui care conține heparină la 0, 1, 2, 3 și 4 h după administrarea uleiului de măsline. Concentrația de trigliceride plasmatice a fost măsurată cu ajutorul unui analizor VetTest Chemistry (IDEXX Lab). Intestinul subțire a fost colorat cu Oil red O la 12 h după administrarea de ulei de măsline prin gavare, în conformitate cu protocolul producătorului kitului de colorare Oil Red O (MAK194, Sigma-Aldrich). Alimentarea cu o dietă bogată în grăsimi (HFD) (60% kcal de grăsimi, Research Diets, D12492) a început la vârsta de 12 săptămâni și a continuat timp de 8 săptămâni pentru măsurarea trigliceridelor plasmatice și colorarea cu Oil Red O. Sângele a fost prelevat prin vena cozii în tubul de colectare a sângelui care conține heparină după 6 h de post. Pentru colorarea cu Oil red O a secțiunilor hepatice, ficatul recoltat, fixat în PFA 4% peste noapte la 4 °C, a fost tăiat în secțiuni vibratome de 100 μm (Leica, VT1200S), a fost colorat cu Oil red O.

Transducția de AAV

Șoarecii indicați au primit o singură injecție i.p. doză unică (1012 particule virale în 150-200 µl) de AAV recombinant care codifică domeniile de legare a ligandului 1-4 ale VEGFR3 fuzionate cu domeniul IgG Fc (AAV-mVEGFR31-4-Ig), iar șoarecii de control au primit aceeași doză de AAV care codifică domeniile 4-7 ale VEGFR3, care nu se leagă de VEGF-C sau VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), fuzionate cu domeniul IgG Fc, așa cum a fost descris anterior37. AAV-mVEGFR31-4-Ig și AAV-mVEGFR34-7-Ig au fost detectate în ser prin analiză prin imunoblotting (anticorp anti-VEGFR3; policlonal de capră, AF743, R&D) de 0.5 μl de probe de ser recoltate în aceeași zi cu analiza intestinală.

Tratarea anticorpilor

Pentru blocarea VEGFR2, am utilizat un anticorp neutralizant VEGFR2 (DC101). O linie celulară de hibridom care produce DC101 a fost achiziționată de la American Type Culture Collection (ATCC). Celulele de hibridom au fost cultivate în mediu fără ser. Proteinele recombinante din supernatante au fost purificate prin cromatografie pe coloană cu gel de agaroză Protein A (Oncogene). După purificare, proteinele recombinate au fost cuantificate cu ajutorul testului Bradford și confirmate prin colorare cu albastru Coomassie după electroforeza pe gel de dodecil sulfat de sodiu (SDS)-poliacrilamidă (PAGE). DC101 (50 mg/kg) sau o cantitate egală de anticorp de control (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) a fost injectat i.p. la șoarecii indicați, la fiecare 2 zile, timp de 2 săptămâni.

Îmbogățirea LEC intestinale și izolarea IntSC din intestinul subțire

Serosa, stratul muscular și țesuturile adipoase mezenterice au fost îndepărtate din intestinul subțire. După deschiderea longitudinală a fragmentelor de intestin și spălarea cu PBS, probele au fost tăiate în bucăți de 2 cm și au fost îndepărtate plasturii Peyer. Probele au fost spălate cu PBS și incubate cu 10 mM EDTA cu DMEM fără calciu și magneziu (Gibco) la gheață timp de 20 de minute. Țesuturile au fost vortexate cu PBS fără calciu până la obținerea unui supernatant limpede, lipsit de celule epiteliale. Bucățile de probă au fost tăiate în continuare în fragmente de 1 mm și disociate cu un tampon de disociere care conține 2 mg/ml colagenază II (Worthington), 1 mg/ml Dispază (Gibco) și 1 U/ml DNază (Invitrogen) în DMEM la 37 °C timp de 30 de minute. Pentru a ajuta la disociere, bucățile de țesut au fost ușor pipăite în sus și în jos la fiecare 10 min. Probele au fost apoi filtrate printr-un filtru de 70 μm pentru a dezagrega mecanic fragmentele intestinale rămase. După colectarea supernatantelor, s-a adăugat un volum egal de DMEM care conține 10% ser fetal de bovine (FBS). După centrifugare, celulele au fost resuspendate în PBS. Pentru a îmbogăți fracțiunea de celule stromale și LEC, celulele hematopoietice și celulele epiteliale au fost epuizate cu ajutorul AutoMACS (Miltenyi) după ce au fost incubate timp de 15 min la gheață cu microbile anti-CD45 și anti-CD326 (Miltenyi). Pentru izolarea IntSC, s-au adăugat Microbeads anti-CD31 (Miltenyi) pentru a epuiza celulele endoteliale în plus față de Microbeads anti-CD45 și anti-CD326.

Cultura primară a IntSC de șoarece

După izolarea IntSC, celulele au fost cultivate cu DMEM/F12 conținând 10% FBS pe o placă de cultură tisulară timp de 24 h sau 2 zile. Pentru tratamentele medicamentoase și pentru colorarea prin imunofluorescență, 50.000 de celule pe puț au fost plasate pe lame de cameră Nunc Lab-Tek II cu 4 puțuri (Sigma-Aldrich). Concentrațiile de medicament sunt descrise în legendele figurilor indicate, iar tratamentele au durat 6 h pentru analiza imunofluorescenței și a expresiei genice. Pentru cultivarea IntSC pe matrici moi (1,5 kPa) și rigide (28 kPa) a fost utilizată o farfurie de imagistică de 35 mm cu o suprafață cu suport elastic (Ibidi) pentru 24 h. Pentru inducerea activității cre în IntSC cultivate primare derivate de la șoareci WT sau Yap/Tazi∆FRC, celulele au fost tratate cu 5 µM de 4-hidroxi-tamoxifen (4-OHT) în etanol 100% (EtOH) sau 100% EtOH singur timp de 2 zile ca martor. Monostraturile de IntSCs expandate prin cultură care au fost validate ca PDGFRβ+ au fost utilizate pentru experimente.

Citometrie în flux și sortare celulară

Pentru a sorta IntSCs PDGFRβ+ sau LECs intestinale, fracțiunile îmbogățite au trecut la liza RBC prin suspendare în tampon de liză ACK (Gibco) timp de 5 min la RT. După blocarea receptorilor Fcγ cu anti-CD16/CD32 de șoarece (553141, BD Bioscience), celulele au fost incubate timp de 15 min cu anticorpii indicați în tampon FACS (2% FBS în PBS). După mai multe spălări, celulele au fost analizate cu FACS Canto II (BD Biosciences), iar datele obținute au fost evaluate în continuare cu ajutorul software-ului FlowJo (Treestar). Sortarea celulelor a fost realizată cu FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Celulele moarte au fost excluse cu ajutorul colorării cu DAPI (Sigma-Aldrich), iar dublurile de celule au fost excluse sistematic. Intensitatea fluorescenței este exprimată în unități arbitrare pe o scară logaritmică, iar dispersia înainte și dispersia laterală sunt reprezentate pe o scară liniară. Următorii anticorpi au fost utilizați pentru citometria de flux: FITC anti-mouse CD45 (11-0451-85, monoclonal de șobolan, Biolegend); FITC anti-mouse TER-119 (11-5921-85, monoclonal de șobolan, Biolegend); APC anti-mouse CD31 (551262, monoclonal de șobolan, BD Bioscience); și PE/Cy7 anti-mouse Podoplanin (127412, monoclonal de hamster sirian, Biolegend).

Secvențierea ARN în masă

Secvențierea ARN în masă a IntSC-urilor PDGFRβ+ izolate a fost realizată prin obținerea fișierului de aliniere. Pe scurt, citirile au fost mapate cu ajutorul instrumentului software TopHat. Fișierul de aliniere a fost utilizat pentru a asambla transcriptele, pentru a estima abundența acestora și pentru a detecta expresia diferențială a genelor sau a izoformelor utilizând manșete. Instrumentul Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Pathway Analysis) (QIAGEN) a fost utilizat pentru a evalua în continuare datele în contextul semnalizării canonice și pentru a determina dacă genele hiperactivate de YAP/TAZ au fost legate în mod specific de moleculele secretorii. Semnificația semnalizării canonice a fost testată prin procedura Benjamini-Hochberg, care ajustează valoarea P pentru a corecta comparațiile multiple, iar activarea sau inhibarea acestora a fost determinată cu referire la scorurile z de activare. Analiza clusterelor și heatmaps au fost generate cu ajutorul Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Pentru GSEA, au fost utilizate colecțiile de seturi de gene din Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/).

MEFs și HDLECs

Fibroblastele embrionare de șoarece (MEFs) au fost izolate din embrionii E12,5, așa cum a fost descris anterior32. Pe scurt, au fost îndepărtate țesuturile capului, membrelor și inimii, iar probele au fost tocate cu o foarfecă și digerate cu 0,1% tripsină/EDTA cu DNază (1 U/ml, Invitrogen) la 37 °C timp de 20 min. După digestie și îndepărtarea țesuturilor nedigerate, celulele au fost centrifugate pentru scurt timp, plasate pe o farfurie de 10 cm și lăsate să crească până la subconfluență. MEF-urile au fost apoi menținute în DMEM/F12 conținând 10% FBS. Celulele endoteliale limfatice dermice umane (HDLECs) au fost achiziționate de la Lonza și cultivate în mediu de creștere endotelială (EGM2-MV, Lonza). MEFs și HDLECs au fost utilizate la pasajul 2 sau 3. Celulele au fost incubate într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2 la 37 °C și s-a confirmat că sunt micoplasma-negative (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Dezvoltarea pe bază de sferoizi

Sferoizii SFELEC au fost generați prin cultivarea HDLECs la pasajul 2 sau 3 în mediu de cultură care conține 0,25% metilceluloză și incubarea peste noapte ca picături suspendate36. Sferoizii au fost apoi colectați și încorporați în 2 mg/ml colagen de tip I (Corning), tratați cu albumină serică bovină de control (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) sau ANGPT2 (5 μg/ml, generat in-house) cu sau fără VEGF-C (200 ng/ml, RD Systems) în mediu bazal pentru celule endoteliale (PromoCell) conținând 1% FBS timp de 24 h. La sfârșitul incubării, sferoizii au fost colorați cu cell tracker (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 min). Sferoizii au fost apoi fixați în 4% PFA timp de 15 min la RT și au fost vizualizați cu ajutorul Cell observer (Carl Zeiss).

RTT-PCR cantitativă

ARN-ul a fost extras cu ajutorul kitului RNeasy Micro (Qiagen) sau al kitului de extracție ARN Trizol (Invitrogen). Un total de 1 µg de ARN extras a fost transcris în ADNc folosind GoScript Reverse Transcription Kit (Promega). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată cu ajutorul FastStart SYBR Green Master mix (Roche) și a termociclatorului S1000 (Bio-Rad) cu primerii indicați. Amorsele au fost proiectate utilizând Primer-BLAST sau adoptate din studii publicate anterior, care sunt descrise în tabelul suplimentar 1. Gapdh a fost utilizată ca genă de referință, iar rezultatele au fost prezentate ca expresii relative față de control. Specificitatea reacției de amorsare a fost confirmată prin analiza curbei de topire. Expresia relativă a genelor a fost analizată prin metoda ΔΔCt folosind software-ul CFX Manager (Bio-Rad).

Experimentele de întindere și osmotice in vitro

MEF-urile și IntSC-urile primare de șoarece au fost întinse folosind un instrument mecanic de întindere celulară (STREX) cu o întindere liniară de 4% la 10 cicluri/min, iar stresul osmotic a fost aplicat cu sorbitol 0,4 M timp de 3 ore, așa cum a fost descris anterior40,50. Celulele au fost menținute într-un incubator umidificat cu 5% CO2 la 37 °C în timpul tuturor experimentelor.

Experimente osmotice ex vivo

După deschiderea cavității abdominale sub anestezie, partea de jejun a intestinului subțire a fost tăiată în bucăți de 2 cm. Fragmentele de intestin au fost deschise longitudinal și spălate cu PBS. Țesuturile au fost apoi cultivate în DMEM/F12, inclusiv 5% FBS, iar stresul osmotic a fost aplicat imediat cu sorbitol 0,4 M în mediul de cultură timp de 3 h. Țesuturile au fost păstrate într-un incubator umidificat cu 5% CO2 la 37 °C în timpul tuturor experimentelor.

Colorarea prin imunofluorescență a MEF-urilor

MEF-urile au fost plasate pe lame de cameră Nunc Lab-Tek II cu 8 puțuri (Sigma-Aldrich) și fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 15 min la 4 °C. După mai multe spălări cu PBS, probele au fost blocate cu 5% ser de capră (sau de măgar) în 0,5% PBST timp de 30 min la RT. Celulele au fost incubate cu anticorpii primari indicați la 4 °C peste noapte. Anticorpii primari legați au fost detectați prin incubarea cu anticorpi secundari timp de 90 min la RT. Următorii anticorpi primari au fost utilizați pentru colorarea celulelor: anticorpi anti-YAP (monoclonal de iepure, 14074, Cell signaling); anticorpi anti-TAZ (policlonal de iepure, HPA007415, Sigma-Aldrich); și anticorpi anti-phalloidin (A12379, Thermo Fisher) conjugat cu Alexa Fluor 488. Anticorpii secundari conjugați cu Alexa Fluor 594 au fost achiziționați de la Jackson ImmunoResearch. Nucleii au fost colorați cu DAPI (Invitrogen), iar lamelele au fost montate și imaginate conform descrierii de mai sus.

ChIP-qPCR

MEF-urile au fost fixate cu 1% PFA timp de 10 min și stinse cu glicină. Probele au fost spălate cu PBS și lizate cu tampon de liză care conține 1% SDS. ADN-ul fixat în lizatul celular a fost sonicat cu ajutorul Focused-ultrasonicator (Covaris). Lizații celulare au fost centrifugați și toate supranaturile rezultate, cu excepția a 5 % (păstrate pentru controlul de intrare a lizatului de celule întregi), au fost diluate cu un tampon de diluție ChIP care conține 0,5 % Triton X-100. Probele diluate au fost apoi incubate peste noapte la 4 °C cu anticorpul anti-TEAD4 (monoclonal de șoarece, ab58310, Abcam). Apoi, s-a adăugat proteina A/G Dynabeads (Thermo Fisher) și probele au fost incubate timp de 2 ore la 4 °C. Sferele au fost izolate cu DynaMag-2 (Thermo Fisher), spălate cu o serie de tampoane de spălare ChIP: tampon de spălare cu conținut scăzut de sare, tampon de spălare cu conținut ridicat de sare, tampon de spălare LiCl și tampon TE. Probele au fost eluate în 1% SDS de două ori timp de 15 minute fiecare la 65 °C. Sferele au fost îndepărtate și atât materialul eluat, cât și eșantioanele de intrare din lizatul de celule întregi de 5% au fost reticulați peste noapte la 65 °C. După normalizarea pH-ului, probele au fost incubate timp de 30 min cu RNază (3 μg/mL) la 37 °C și timp de 2 h cu proteinază K (20 mg/ml) și glicogen (20 mg/ml) la 55 °C. ADN-ul a fost eluat folosind procedurile standard, iar ChIP-DNA au fost analizate prin qPCR în comparație cu probele de intrare folosind primerii enumerați în tabelul suplimentar 2.

ELISA

Supernatantul de IntSCs de șoarece cultivate primar au fost recoltate după întindere, iar supernatantul a fost centrifugat timp de 15 min. Concentrația de VEGF-C în supernatant a fost măsurată prin testul imunoenzimatic (ELISA) cu kitul ELISA specific VEGF-C de șoarece (CSB-E07361m, Cusabio).

Analiză morfometrică

Măsurătorile morfometrice au fost efectuate cu ajutorul software-ului ImageJ (NIH), software-ul ZEN 2012 (Carl Zeiss) sau Imaris (Bitplane). Pentru cuantificarea suprafeței lacteale, s-a stabilit un prag pentru imaginile care urmează să fie analizate și s-a măsurat suprafața absolută a vilozității LYVE-1+ pentru fiecare vilozitate din cadrul vilozității. Lungimea absolută a lacteei, lungimea absolută a vilozităților și lățimea absolută a vilozităților au fost măsurate folosind imagini ale imunocolorației vilozităților E-cadherină+ sau CD31+ sau LYVE-1+ în fiecare câmp aleatoriu de 850 µm2 din partea indicată a intestinului. Pentru cuantificarea suprafeței lacteale și a vilozităților, a lungimii și a lățimii, au fost analizate cel puțin 100 de vilozități de-a lungul întregului intestin subțire. Cuantificările pentru următorii parametri din intestinul subțire au fost efectuate în jejunum. Numărul de germeni lacteali și numărul de ramificații lacteale au fost măsurate în 10-20 de lacteale LYVE-1+ aleatorii. Numărul de LEC Prox1+ și numărul de LEC Prox1+EdU+ au fost numărate manual pe o lungime de 100 μm în 10-20 de lactee LYVE-1+ aleatorii. Cuantificarea joncțiunilor VE-cadherină+ din lactee a fost realizată cu obiectivul ×40 în lactee de 5-10 vilozități pe șoarece. Pe scurt, joncțiunea de tip fermoar a fost definită ca joncțiuni continue la granițele celulă-celulă cu celule care au formă alungită51. Joncțiunea de tip buton a fost definită ca joncțiuni discontinue care nu sunt paralele cu granițele celulă-celulă și cu celule cu formă de frunză de stejar. Joncțiunile care nu corespund niciunui model au fost clasificate ca fiind de tip mixt. Intensitatea de fluorescență (IF) a BODIPY și cuantificarea acesteia au fost efectuate conform descrierii anterioare34. Suprafața Oil red O a fost măsurată ca suprafață Oil red O+ împărțită la suprafața vilozităților și normalizată cu media celor de la șoarecii de control. Suprafața de acoperire a celulelor musculare netede din vilozități a fost măsurată ca suprafață absolută de acoperire αSMA+ în cinci câmpuri de 850 µm2 pentru fiecare probă, care a fost apoi normalizată cu media celor de la șoarecii de control. Pentru a cuantifica expresiile relative ale VEGFR3 lacteal, FI mediu măsurat în cinci câmpuri de 425 µm2 pe eșantioane și a fost prezentat ca valori relative împărțite la valorile sale de control. Pentru a determina densitatea vaselor de sânge, suprafața VEGFR2 a fost măsurată în cinci câmpuri de 425 µm2 pe eșantion și prezentată ca valori relative față de controlul său. Suprafața celulelor T CD3+ sau a macrofagelor F4/80+ a fost măsurată în cinci câmpuri de 425 µm2 per eșantion. Densitatea vaselor limfatice a fost calculată prin măsurarea suprafeței LYVE-1+ în cinci câmpuri aleatorii de 425-850 µm2 din eșantioane de montare integrală și prezentată ca valori relative față de controlul său.

Secvențierea ARN-ului monocelular pe bază de picături

Celeulelele unice sortate au fost procesate cu ajutorul kitului 10X Chromium Single cell Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) în conformitate cu protocoalele producătorului. Pe scurt, celulele sortate au fost resuspendate în PBS cu 0,5 % BSA și au fost amestecate cu amestecul de reactivi RT și amorsă RT, care au fost apoi adăugate la fiecare canal din cipurile 10X, vizând 5 000 de celule. Celulele au fost separate în perle de gel în emulsie, unde transcrierile de ARN de la celule individuale au fost codate cu bare și transcrise invers. După construcția și amplificarea bibliotecii de ADNc, moleculele de ADNc au fost fragmentate enzimatic, reparate la capăt și cu coadă A. După selectarea mărimii adecvate a moleculelor de ADNc procesate prin selectarea mărimii duble cu ajutorul perlelor SPRI (Beckman Coulter), acestea au fost ligaturate cu un adaptor și s-a efectuat PCR cu indice de eșantionare. După o altă selecție de dimensiuni duble cu ajutorul bilelor SPRI, construcțiile finale ale bibliotecii au fost diluate de 10 ori și au fost rulate pe Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip pentru controlul calității. Bibliotecile unicelulare au fost apoi secvențiate cu ajutorul platformei Illumina HiSeq-X.

Preprocesarea datelor ARN unicelulare

Datele brute de secvențiere au fost mai întâi demultiplexate și mapate pe genomul de referință al șoarecilor (mm10) cu ajutorul setului de instrumente Cell Ranger 3.0.2 de la 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Utilizând pachetul R Seurat (versiunea 3.0.0)52 , matricile de expresie brute au fost construite cu ajutorul funcției Read10X. Au fost excluse celulele cu mai puțin de 1 000 de gene detectate sau cu mai mult de 6 000 de gene detectate (considerate ca potențiale dublete) (Fig. suplimentară 17a). În plus, celulele cu un număr mare de identificatori moleculari unici (UMI) asociați genelor mitocondriale (>7% din total) au fost considerate celule moarte și, prin urmare, au fost excluse. Pentru gene, au fost eliminate cele exprimate de mai puțin de 3 celule. În plus, un număr mic de celule imunitare Ptprc+ contaminante și de celule endoteliale Pecam1+ Cdh5+ contaminante au fost excluse după runda inițială de grupare. După eliminarea celulelor și a genelor nedorite, numărul de UMI pentru fiecare genă pentru o celulă a fost împărțit la expresia totală a unei anumite celule și înmulțit cu 10.000 și transformat în log-transformare. Apoi, genele au fost scalate și centrate prin regresia variabilelor, cum ar fi procentul de gene mitocondriale și numărul de UMI-uri.

Identificarea genelor variabile și reducerea dimensionalității

Pachetul R Seurat a fost utilizat pentru analiza de clusterizare. În primul rând, genele foarte variabile din setul de date au fost identificate cu ajutorul funcției FindVariableFeatures din Seurat cu opțiunea: selection.method = „vst”. Primele 2000 de gene cu cea mai mare variabilitate au fost selectate pentru analiza în aval. Utilizând genele variabile identificate, s-au efectuat reduceri inițiale ale dimensionalității cu ajutorul analizei componentelor principale (PCA). Funcția JackStraw a fost utilizată pentru a determina semnificația statistică a scorurilor PCA. Cele mai semnificative 30 de componente principale (PC) au fost utilizate ca intrare pentru Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) pentru a reduce datele într-un spațiu bidimensional.

Analiză cluster

Pentru a grupa celulele în funcție de profilurile lor transcripționale, am efectuat o grupare nesupravegheată pe cele mai importante 2000 de gene foarte variabile pentru toate cele patru probe. Am construit mai întâi un grafic al celor mai apropiați vecini partajați (SNN) în spațiul componentelor principale utilizând funcția FindNeighbors. Apoi am aplicat algoritmul Louvain pentru o grupare bazată pe optimizarea modularității prin utilizarea funcției FindClusters. Parametrii de rezoluție a clusterelor au fost setați în punctul în care clusterele prezentau profile transcripționale foarte distincte. Clusterele au fost independente de numărul de gene detectate per celulă (Fig. Suplimentară 17b). Markerii specifici clusterelor au fost genele exprimate diferențiat pentru fiecare cluster identificate prin intermediul funcției FindMarkers din Seurat cu următoarele setări: min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15,test.use = „MAST”. Markerii identificați cu P ajustat < 0,05 au fost utilizați pentru analize ulterioare. Deoarece unele tipuri de celule, cum ar fi celulele musculare netede și celulele murale, aveau markeri bine cunoscuți, apariția lor în partea de sus a listei de markeri pentru fiecare cluster a validat procesele noastre de selecție a markerilor. Pentru a elimina sursele nedorite de variații, cum ar fi sexul, celulele au fost împărțite în funcție de prezența transcriptului specific feminin Xist și integrate. Pentru a realiza integrarea diferitelor seturi de date, am normalizat mai întâi logarhic fiecare matrice de expresie brută și am identificat primele 2000 de gene foarte variabile pentru fiecare set de date. Apoi, cu ajutorul funcției FindIntegrationAnchors din Seurat, am identificat punctele de ancorare între seturile de date. Apoi, seturile de date au fost integrate pe baza ancorelor identificate prin intermediul funcției IntegrateData din Seurat. Seturile de date integrate au fost apoi scalate și dimensiunile au fost reduse pentru o analiză suplimentară a clusterelor. Clusterele din seturile de date integrate au fost adnotate prin profilurile lor de expresie ale genelor din listele de creatori identificate.

Analiza de îmbogățire a ontologiei genice

Analiza de îmbogățire a ontologiei genice asupra markerilor de cluster au fost efectuate cu ajutorul pachetului R goseq (versiunea 1.34.0)53. În funcție de lungimea genei, au fost obținute ponderări pentru fiecare genă și a fost utilizată aproximația Wallenius pentru a identifica termenii ontologici genetici asociați. Au fost selectați termenii de ontologie genetică care au P ajustat < 0,05 și categoriile de procese biologice.

Statistică

Nu au fost utilizate metode statistice pentru a determina în prealabil dimensiunea eșantionului. Experimentele au fost randomizate, iar investigatorii au fost orbiți în ceea ce privește alocarea în timpul experimentelor și analizelor rezultatelor. Toate valorile sunt prezentate ca medie ± deviație standard (SD). Semnificația statistică a fost determinată prin testul Mann-Whitney U cu două fețe între două grupuri sau prin ANOVA cu două căi cu testul de comparații multiple Holm-Sidak pentru comparații între mai multe grupuri. Analizele statistice au fost efectuate utilizând GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.