Eine DNA-Polymerase ist ein wichtiges biologisches Enzym, das bei der DNA-Replikation vorhanden ist. Dabei wird die DNA in zwei Tochter-DNA-Moleküle kopiert und ein neuer DNA-Strang aus dem bestehenden Strang synthetisiert, indem dNTPs zur wachsenden DNA hinzugefügt werden.
Die DNA-Polymerase hat zwei entscheidende Aufgaben bei der Replikation: Die 5′ zu 3′ Exonuklease-Polymerase-Aktivität und die 3′ zu 5′ Exonuklease-Korrekturlese-Aktivität. Wenn die Polymerase an die DNA bindet, fügt sie Nukleotide in der Richtung von 5′ nach 3′ hinzu.
Da sie bei einer höheren Temperatur deaktiviert wird, ist die DNA-Polymerase leider nicht für eine Art der Replikation, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), geeignet. Die Taq-DNA-Polymerase hingegen spielt eine wesentliche Rolle bei der PCR.
Was ist Taq Polymerase?
Taq DNA Polymerase ist eine hoch thermostabile rekombinante DNA Polymerase. Sie ist benannt nach Thermus aquaticus, dem hitzetoleranten Bakterium, aus dem sie sich isoliert. Das Molekulargewicht der Taq-Polymerase beträgt 94kD, und sie amplifiziert DNA bis zu 5kb mit einer Elongationsgeschwindigkeit von 0,9-1,2kb/min bei 70-75°C.
Was ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)?
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Replikationstechnik, bei der zahlreiche Kopien einer bestimmten DNA-Region in vitro (in einem Reagenzglas und nicht in einem Organismus) hergestellt werden. Die PCR wird in verschiedenen Bereichen der Biologie und Medizin eingesetzt, darunter in der molekularbiologischen Forschung, der medizinischen Diagnostik und der Ökologie.
Die PCR beruht auf der Taq-Polymerase, einer thermostabilen DNA-Polymerase. Sie benötigt außerdem DNA-Primer, die speziell für die interessierende DNA-Region entwickelt wurden, sowie Template-DNA und Nukleotide (DNA-Bausteine).
Bei einer PCR-Reaktion werden die Hauptbestandteile in einem Röhrchen zusammen mit den Kofaktoren, die das Enzym benötigt, zusammengebracht. Die Bestandteile durchlaufen wiederholte Zyklen des Erhitzens und Abkühlens, bei denen schließlich die DNA synthetisiert wird.
Es gibt außerdem drei grundlegende Schritte, die du für die PCR befolgen musst, darunter:
- Denaturierung (96 °C): Die Reaktion wird stark erhitzt, um die DNA-Stränge zu trennen bzw. zu denaturieren.
- Annealing (55-65 °C): Die Reaktion wird abgekühlt, damit sich die Primer an ihre komplementären Sequenzen auf der einzelsträngigen Template-DNA binden können.
- Verlängerung (72 °C): Erhöhen Sie die Reaktionstemperaturen, damit die Taq-Polymerase die Primer verlängert und neue DNA-Stränge synthetisiert.
Der Zyklus wiederholt sich 25-35 Mal in einer typischen PCR-Reaktion, die im Allgemeinen 2-4 Stunden dauert, je nach Länge der zu kopierenden DNA-Region. Wenn die Reaktion effizient ist, kann die Zielregion von nur einer oder wenigen Kopien auf Milliarden anwachsen.
Die Rolle der Taq-Polymerase in der PCR
Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Synthese und Vervielfältigung neuer DNA-Stränge ist die Taq-DNA-Polymerase für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unerlässlich.
Wie andere DNA-Polymerasen kann die Taq-Polymerase nur dann DNA produzieren, wenn sie einen Primer hat, eine kurze Sequenz von 20 Nukleotiden, die den Ausgangspunkt für die DNA-Synthese bildet. Sie ist jedoch auch eine thermostabile DNA-Polymerase, die bei höheren Temperaturen arbeiten kann.
Taq-DNA-Polymerase ist hocheffizient, d. h. sie ist voll funktionsfähig, sobald sie ihre optimale Temperatur erreicht hat. Sie hat außerdem eine Halbwertszeit von mehr als zwei Stunden (bei einer Temperatur von 92 °C), eine hohe Amplifikationskapazität und die Fähigkeit, 150 Nukleotide pro Sekunde hinzuzufügen.
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