U.S. Food and Drug Administration

ITG SUBJECT: PYROGEN, IMMER NOCH EINE GEFAHR

Einleitung

Mit der Einführung der Injektionsnadel wurde ein neuer Weg zur Verabreichung von Medikamenten geschaffen. \Nach heutigen Maßstäben waren die frühen parenteralen \a)\Medikamente jedoch grob und unsicher, da die zunehmende Verwendung dieser frühen Injektionslösungen zu Infektionen, unerwünschten Arzneimittelwirkungen, Fieber unbekannter Ätiologie und sogar zu Todesfällen durch Schock führte. Für die ersten Mikrobiologen war es verwirrend, dass selbst bei der Injektion von sterilen Lösungen sporadisch Fieber auftrat.

Moderne Injektionslösungen sind sicherer, dennoch wird in der Literatur weiterhin über unerwünschte Reaktionen berichtet. In dieser Ausgabe befassen wir uns mit den Sorgen von Patienten, die aufgrund von Operationen oder bestimmten Krankheiten keine Flüssigkeit über den Mund einnehmen können, und die unter den Folgen unerwünschter Toxine leiden könnten, die als fiebererzeugende Substanzen bekannt sind, falls sie im parenteralen Produkt enthalten sind. Wir hoffen, von den Erkenntnissen auf diesem Gebiet zu profitieren.

Historisches – Pyrogene

In der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts war bekannt, dass einige parenterale Lösungen einen deutlichen Anstieg der Körpertemperatur verursachen. Die fiebererzeugenden Substanzen waren nicht bekannt. Krankheiten, die auf diese „Fiebersubstanz“ zurückzuführen waren, wurden unter anderem als „Injektionsfieber“, „destilliertes Wasserfieber“ und „Kochsalzfieber“ bezeichnet. Heute weiß man, dass bakterielle Pyrogene für viele dieser frühen Fiebererkrankungen und für viele der anderen biologischen Wirkungen, die im Zusammenhang mit der parenteralen Therapie beschrieben wurden, verantwortlich sind. Daraus wird ersichtlich, warum bei der Zubereitung und Anwendung von Injektionslösungen größte Sorgfalt darauf verwendet werden muss, das heimliche Pyrogen auszuschließen.

Natürliche Abwehr und Pyrogene

Als gesunde Menschen, die einer universellen Verteilung von Mikroben in der Umwelt ausgesetzt sind, koexistieren wir mit der mikrobiellen Welt. Normalerweise beschränken die natürlichen Abwehrkräfte des Körpers die Mikroben und ihre Stoffwechselprodukte (Toxine usw.) auf Bereiche, in denen sie toleriert werden können, wie z. B. auf der Haut und im Verdauungstrakt. Durch die parenterale Verabreichung eines Arzneimittels kann ein eventuell vorhandenes Pyrogen die normale Körperabwehr umgehen. Die Reaktion des Wirts wird durch die Leukozyten (weiße Blutkörperchen) vermittelt, die ihrerseits eine eigene Art von Pyrogen (endogenes Pyrogen) freisetzen, was wiederum die fiebrige Reaktion und eine Vielzahl anderer biologischer Reaktionen auslöst.

Biologische Wirkungen von Endotoxinen

Die große Vielfalt biologischer Wirkungen, die bakteriellen Pyrogenen zugeschrieben werden, haben großes Interesse geweckt. \3\, \4\ Die Reaktionen des Wirts auf Pyrogene lassen sich in folgende Kategorien einteilen: 1) Fiebererzeugung, 2) Schock und 3) Veränderungen der physiologischen Funktionen.

Fieber ist eine bekannte Wirkung, daher der Begriff „Pyrogen“. Etwa eine Stunde nach der Injektion von Pyrogenen in Kaninchen (oder Menschen) kommt es zu einem Anstieg der Körpertemperatur. Werden bakterielle Pyrogene in ausreichender Menge, etwa im Mikrogrammbereich, injiziert, wird das Fieber von Schüttelfrost, Körperschmerzen, Blutdruckanstieg und möglicherweise Schockzustand und Tod begleitet. Bei kleineren Injektionsmengen zeigt der Körper eine erhöhte Kapillardurchlässigkeit und eine Vielzahl anderer Kreislaufveränderungen. Beispiele für diese Veränderungen sind eine Verminderung und anschließende Erhöhung der Zahl der weißen Blutkörperchen, Tumorblutungen und Veränderungen des Venendrucks.

In besonderen Fällen können Pyrogene das Shwartzman-Phänomen zeigen. Dabei handelt es sich um eine schwere hämorrhagische Reaktion mit lokalisierter Nekrose. Sie kann an einem Kaninchen demonstriert werden, dem zunächst subkutan ein bakterielles Pyrogen injiziert wird und das dann 24 Stunden später intravenös das gleiche Pyrogen erhält. Die Stelle der späteren Injektion färbt sich in der Mitte blau und an der Peripherie rot.

Pyrogentoleranz ist eine weitere wichtige Reaktion, die sich entwickelt, wenn die Tiere wiederholt ein Pyrogen injiziert bekommen. Es entwickelt sich eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber demselben und anderen Pyrogenen, die die fiebrige Reaktion aufhebt und es erforderlich macht, das tolerante Tier von weiteren Pyrogentests auszuschließen. „Empfindlichkeit“ bedeutet, dass das Tier auf eine minimale Menge an pyrogenem Material reagiert. Obwohl das Kaninchen das am häufigsten verwendete Versuchstier ist, gilt der Mensch als das empfindlichste Tier für Pyrogene.

Bakterielle Toxine

Es gibt zwei allgemeine Arten von bakteriellen Toxinen.

Exotoxine werden während der Wachstumsphase bestimmter Bakterienarten produziert und in das Medium oder Gewebe freigesetzt. Exotoxine sind von Natur aus proteinhaltig und ihre Reaktionen sind spezifisch. Clostridium botulinum beispielsweise produziert ein Exotoxin von ungewöhnlicher Potenz, das nur neurologisches Gewebe angreift. Andere bekannte Beispiele für Exotoxine sind Tetanus-Toxin, Shiga-Toxin und Diphtherie-Toxin.

Endotoxine sind eine weitere Art von Toxinen, die aus einer Vielzahl von gramnegativen Bakterien gewonnen werden können. Der Begriff „Endotoxin“ ist in der Regel austauschbar mit dem Begriff „Pyrogen“, obwohl nicht alle Pyrogene Endotoxine sind und Pyrogentests allein nicht vollständig für den Nachweis und die Charakterisierung von mikrobiellen Endotoxinen verwendet werden können. Um eine tödliche Wirkung bei Versuchstieren zu erzielen, sind höhere Endotoxindosen erforderlich als bei Exotoxinen. Die von Endotoxinen beim Wirt hervorgerufenen Wirkungen sind systemischer Art, wie Fieber und allgemeine Körperreaktionen, und nicht rein neurologisch, wie es bei den meisten Exotoxinen der Fall ist. Endotoxine kommen vor allem bei gramnegativen Bakterien vor und werden nach dem Tod und der Autolyse der Zellen gewonnen. Die Endotoxine werden aus der Zellstruktur (Zellwand) extrahiert und mit dieser verbunden. Gute Beispiele für Pyrogene produzierende Bakterien sind S. typhosa, E. coli und Ps. aeruginosa.

Zusätzliche Eigenschaften von Pyrogenen

Bei der Aufzählung zusätzlicher Eigenschaften lässt sich sagen, dass Pyrogene: (1) bekanntermaßen biochemisch aus einer Lipid-Polysaccharid-Peptid-Substanz bestehen; (2) bei der Temperatur von kochendem Wasser hitzestabil sind; (3) eine relativ geringe akute Toxizität für den Menschen aufweisen; (4) eine geringe Ordnung der Immunreaktion zeigen; und (5) von persistenten gramnegativen Bakteriämien produziert werden können, die eine Sterblichkeitsrate von 50 % haben können. \6\

Ärzte sind angehalten, bei persistierenden Bakteriämien sofort nach der Ursache zu suchen. Mögliche Ursachen könnten eine Helbitis an der Katheterstelle, Infusionsgeräte oder die parenterale Lösung sein. Interessant ist, dass die Behandlung von Patienten mit Pyrogenschock die Verabreichung von (hoffentlich nicht-pyrogenen) parenteralen Flüssigkeiten einschließt.

Make it Pyrogen Free

Bakterientötende Verfahren wie Erhitzen, Filtration oder Adsorptionstechniken beseitigen Pyrogene in parenteralen Lösungen nicht. Alle Inhaltsstoffe müssen in erster Linie pyrogenfrei gehalten werden. Um dies zu gewährleisten, führt der Hersteller umfassende Pyrogen-Screening-Tests an allen parenteralen Arzneimittelbestandteilen durch und sorgt für deren ordnungsgemäße Lagerung vor der Verwendung. Im Idealfall erkennt der Hersteller die kritischen Schritte im Herstellungsprozess, die ein Wachstum von pyrogenen Bakterien ermöglichen könnten, und überwacht diese Bereiche routinemäßig. So würde beispielsweise das Wasser in den Vorratsbehältern auf Pyrogene getestet, und der Hersteller würde auf Mindesthaltezeiten bestehen, damit nur pyrogenfreies Wasser verwendet wird. Pyrogenfreies Wasser, wie es in der USP als „Wasser für Injektionszwecke“ bezeichnet wird, ist das Herzstück der Parenteralia-Industrie.

Pyrogen Assay – USP

In der aktuellen USP wird der Pyrogentest klar umrissen. Nach USP XIX gilt eine Lösung als pyrogen, wenn 10 m1/kg in ein Kaninchen injiziert werden und bei einem Kaninchen ein Temperaturanstieg von 0,6 C oder mehr oder bei drei Kaninchen in einer Testgruppe von drei Kaninchen ein Gesamttemperaturanstieg von mehr als 1,4 C auftritt. Die offizielle Kaninchenmethode erfordert viel Zeit, Geld, Ausbildung und Erfahrung, um sie zu beherrschen. Es gibt nur wenige Abkürzungen. Die Konsequenz, nicht auf Pyrogene zu testen, könnte in Form von Patientenreaktionen und Arzneimittelrückrufen noch kostspieliger sein.

Pyrogentest – Limulus-Amöbozyten-Lysat

Viele Laboratorien führen Pyrogentests mit Hilfe der Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL)-Methode durch. \Die LAL-Methode ist vor allem für das Screening von Produkten nützlich, die mit der Kaninchenmethode nicht getestet werden können. Produkte, die am besten mit der LAL-Methode auf Endotoxine getestet werden, sind: Radiopharmazeutika, Anästhetika und viele biologische Produkte. Im Wesentlichen wird bei der LAL-Methode die Hämolymphe (Blut) einer Hufeisenkrabbe (limulus polyphemus) mit einem Endotoxin zur Bildung eines Gels umgesetzt. Die Menge an Endotoxin, die geliert, wird durch Verdünnungstechniken bestimmt, bei denen die Gelbildung einer Testprobe mit der eines Referenzpyrogens verglichen wird, oder durch spektrophotometrische Methoden, bei denen die Trübung der Gelbildung einer Testprobe mit der Trübung eines Referenzpyrogens verglichen wird. Der LAL-Test gilt als spezifisch für das Vorhandensein von Endotoxinen und ist mindestens hundertmal empfindlicher als der Kaninchentest. \8\, \9\ Selbst Pikogramm-Mengen von Endotoxinen können mit der LAL-Methode nachgewiesen werden. Obwohl es sich bei der LAL-Methode um eine relativ neue Pyrogentestmethode handelt, wurde eine Vielzahl von Polysaccharidderivaten nachgewiesen, die positive Limulus-Testergebnisse liefern und auch Fieberaktivität zeigen. Einige Firmen verwenden den LAL-Test zum Screening von Pyrogenen in Rohstoffen und führen anschließend Pyrogentests am Endprodukt mit dem USP-Kaninchentest durch. Der LAL-Test für Pyrogene in Arzneimitteln erfordert eine Änderung der NDA auf individueller Produktbasis. Die Reagenzien für den LAL-Test werden vom Bureau of Biologics lizenziert. Für Produkte muss ein Unternehmen sein Protokoll vom Direktor des Bureau of Medical Devices genehmigen lassen, bevor es den LAL-Test durch den Kaninchentest ersetzen kann. \Die Zukunft des LAL-Tests scheint vielversprechend zu sein, denn es wird erwogen, ihn in die USP aufzunehmen, aber er ist derzeit keine offizielle Methode.

Was sicher ist, ist, dass Pyrogene weiterhin eine potenzielle Gefahrenquelle bei der Anwendung der parenteralen Therapie darstellen. Der vollständige Ausschluss von Pyrogenen erfordert eine kontinuierliche Überwachung der Herstellung von parenteralen Arzneimitteln. \a)\Parenteral (para = jenseits; enteron = Darm) Nicht über den Verdauungstrakt, sondern über einen anderen Weg, z. B. subkutan, intramuskulär, intravenös, intraspinal usw.

b)\Pyrogen – ein fiebererzeugender Stoff bakteriellen Ursprungs; Endotoxin. Dorland’s Illustrated Medical Dictionary. 25. E.W.B. Saunders, Philadelphia.

1. Singer, Charles Joseph; Underwood, Edgar Ashworth. A Short History of Medicine. 2nd Ed., 1962. Oxford Univ. Press, NY, and Oxford.
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5. Stainer, Roger Y.; Doudoroff, Michael; Adelberg, Edward A. The Microbial World, Prentice Hall, Inc. 3rd Ed, 1970.
6. Krupp, Marcus A. & Chatton, Milton J.; Current Medical Diagnosis and Treatment. p. 775, Lange Medical Publications, 1975, Los Altos, CA
7. Rastogi, S. C.; Hochstein, H. D.; Seligman, E. B. Jr.; „Statistical Determination of Endotoxin Content in Influenza Virus Vaccine by the Limulus Amoebocyte Lysate Test.“ J. Clin Microbiol 6(2): 144-8, Aug. 1977.
8. Nandan, R.; Nakashima, C. Y., Brown, D. R.; „Detection of Endotoxins in Human Blood and Plasma.“ An improved in-vitro pyrogen test. Clin Chem 23(11): 2080-4 Nov. 1977.
9. Wachtel, R. E.; Tskji, K.; „Comparison of Limulus Amoebocyte Lysates and Correlation with the USP Pyrogen Test.“ Appl. Environ. Microbiology 33(6) 1265-9, June 1977.
10. Docket No. 77N-0282 as found in FR Doc. 77-31926 File 11-3-77 (Vol. 42, No. 213 — Freitag, 4. November 1977) und wie in FR Doc. 78-623 Filed 1-12-78 (Vol. 43, No. 9 — Freitag, 3. Januar 1978)