Unterschiedliche Fibroblasten-Untergruppen regulieren die Integrität der Laktea durch YAP/TAZ-induziertes VEGF-C in Darmzotten

Versuchstiere

Alle Tierpflege- und Versuchsverfahren entsprachen allen ethischen Vorschriften für Tierforschung und -versuche und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (No. KA2016-12) des Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 und Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 Mäuse wurden in spezifisch pathogenfreien (SPF) Tieranlagen am KAIST transferiert, etabliert und gezüchtet. C57BL/6 J, R26-tdTomato und Myh11-Cre-ERT2 Mäuse wurden vom Jackson Laboratory erworben. Alle Mäuse wurden auf dem C57BL/6-Hintergrund gehalten und mit freiem Zugang zu einer Standarddiät (PMI LabDiet) und Wasser gefüttert. Um die Cre-Aktivität in den Cre-ERT2-Mäusen zu induzieren, wurden 2 mg Tamoxifen (Sigma-Aldrich), gelöst in Maisöl (Sigma-Aldrich), zu den angegebenen Zeitpunkten für jeden Versuch intraperitoneal (i.p.) injiziert. Cre-ERT2-negative, aber flox/flox-positive Mäuse unter den Wurfgeschwistern wurden für jeden Versuch als Kontrollmäuse (WT) definiert. Die Mäuse wurden mit einer i.p. Injektion einer Kombination von Anästhetika (80 mg/kg Ketamin und 12 mg/kg Xylazin) betäubt, bevor sie geopfert wurden.

Histologische Analysen

Für die Ganzkörperfärbung des Dünndarms wurde nach der Betäubung eine transkardiale Perfusion mit 2% Paraformaldehyd (PFA) durchgeführt. Der Dünndarm wurde entnommen und in Längsrichtung aufgeschnitten, um das Lumen freizulegen. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Därme auf Silikonplatten fixiert. Die Proben wurden dann 2 Stunden lang bei 4 °C in 4 % PFA nachfixiert. Die Proben wurden mehrmals mit PBS gewaschen und anschließend 2 Stunden lang mit 10 % Saccharose in PBS und über Nacht mit 20 % Saccharose und 10 % Glycerin in PBS dehydriert. Ohrhaut, Luftröhre und Zwerchfell wurden ohne transkardiale Perfusion entnommen und 1 h lang bei 4 °C in 4 % PFA fixiert. Die Proben wurden vor dem Blockieren mehrmals mit PBS gewaschen. Nach der Blockierung mit 5%igem Ziegen- oder Eselserum in 0,5%igem Triton-X 100 in PBS (PBST) für 1 h wurden die Proben mit den angegebenen primären Antikörpern, die in der Blockierungslösung verdünnt waren, über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBST wurden die Proben 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) mit den angegebenen fluorchromkonjugierten Sekundärantikörpern inkubiert, die in dem Blockierungspuffer verdünnt waren. Die Proben wurden mit PBST gewaschen, und die Zellkerne wurden mit DAPI (Invitrogen) gefärbt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Proben mit Vecta-shield (Vector Laboratories) montiert. Die Bilder wurden mit dem konfokalen Mikroskop LSM 800 oder LSM 880 von Zeiss (Carl Zeiss) aufgenommen.

Für die Immunfärbung wurden die folgenden primären und sekundären Antikörper verwendet: anti-LYVE-1 (Kaninchen polyklonal, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (Ratte monoklonal, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (Hamster monoklonal, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-Cadherin (Ziege polyklonal, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (Ziege polyklonal, AF2727, R&D, 1:400); Anti-Prox1 (Kaninchen polyklonal, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); Anti-VE-Cadherin (Ziege polyklonal, AF1002, R&D, 1:200); Anti-PDGFRβ (Ratte monoklonal, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (Maus monoklonal, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (Ziege polyklonal, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (Kaninchen monoklonal, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (Kaninchen polyklonal, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (Kaninchen polyklonal, APR-001, Alomone Labs, 1:800); anti-Ackr4 (Kaninchen polyklonal, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (Ziege polyklonal, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (Kaninchen polyklonal, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (Ziege polyklonal, AF1062, R&D, 1:200); Anti-YAP (Kaninchen monoklonal, 14074, Cell Signaling, 1:200); Anti-TAZ (Kaninchen polyklonal, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); Anti-αSMA, Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-konjugiert (Maus monoklonal, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (Ziege polyklonal, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (Ziege polyklonal, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (monoklonales Kaninchen, 13179, Cell Signaling, 1:400); Anti-F4/80, FITC-konjugiert (monoklonale Ratte, 1231007, Biolegend, 1:200); Anti-CD3 (monoklonaler Hamster, 553058, BD Biosciences, 1:1000); Anti-Desmin (polyklonales Kaninchen, AB907, Millipore, 1:400); und Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-konjugierte Anti-Kaninchen-, Antiratten-, Anti-Ziegen-, Anti-Hamster-Sekundärantikörper (verdünnt im Verhältnis 1:1000) wurden von Jackson ImmunoResearch erworben. Alle in unserer Studie verwendeten Antikörper wurden für die jeweilige Spezies und Anwendung validiert.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH)

Für smFISH im Dünndarm wurde nach der Anästhesie eine transkardiale Perfusion mit 2% PFA durchgeführt. Die Proben wurden 2 Stunden lang bei 4 °C in 4 % PFA nachfixiert. Die Proben wurden mehrmals mit PBS gewaschen, in 30 %ige Saccharose gelegt und über Nacht inkubiert. Die in OCT eingebetteten Proben wurden geschnitten, und wir führten smFISH nach dem Protokoll des Herstellers durch, das im RNAscope Fluorescent Multiplex Assay Kit (320850, ACDBio) beschrieben ist. Die RNA scope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) wurde für smFISH verwendet. Die folgenden primären und sekundären Antikörper wurden für die Immunfärbung mit smFISH verwendet: Anti-PDGFRβ (monoklonaler Ratten-Antikörper, ab91066, Abcam); Anti-Shisa3 (polyklonaler Kaninchen-Antikörper, TA320118, Origene); Anti-P2X1 (polyklonaler Kaninchen-Antikörper, APR-001, Alomone Labs) und Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-konjugierte Sekundärantikörper wurden von Jackson ImmunoResearch erworben. Die Bilder wurden mit dem Zeiss LSM 800 oder LSM 880 Konfokalmikroskop (Carl Zeiss) aufgenommen.

EdU-Inkorporationstest für proliferierende LECs

Um proliferierende LECs in der Tränenflüssigkeit nachzuweisen, wurden 5 mg 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin (EdU, A10044, Invitrogen) in 1 ml Milli-Q Wasser als Stammlösung gelöst. Dann wurden 200 μl der Stammlösung pro Maus eine Woche lang jeden zweiten Tag i.p. injiziert, bevor die Analyse durchgeführt wurde. Der Dünndarm wurde isoliert und wie oben beschrieben aufbereitet. EdU-inkorporierte Zellen wurden mit dem Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) gemäß dem Herstellerprotokoll nachgewiesen.

Elektronenmikroskopie

Um ultrastrukturelle elektronenmikroskopische Bilder von Lacteal aufzunehmen, wurde der Dünndarm nach transkardialer Perfusion mit 4% PFA und 0,25% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) geschnitten. Die Proben wurden dann über Nacht in 2,5%igem Glutaraldehyd fixiert, mit 1%igem Osmiumtetroxid nachfixiert und mit einer Reihe steigender Ethanol-Konzentrationen dehydriert und anschließend in Harz eingebettet. Mit einem Ultramikrotom (UltraCut-UCT, Leica) wurden 70-nm-Dünnschnitte der Laktea angefertigt, die dann auf Kupfergittern gesammelt wurden. Die Proben wurden mit Transmissions-EM (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) bei 120 kV abgebildet, nachdem sie mit 2% Uranylacetat und Bleizitrat gefärbt worden waren.

Intravitales Imaging der Lipidausscheidung aus der Lamina propria

Mäuse wurden vor dem Eingriff 12 Stunden lang betäubt, nachdem ihnen die Nahrung entzogen worden war. Die Intravitalbildgebung wurde wie zuvor beschrieben34 durchgeführt. Die BODIPY-Lipidsonden (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) wurden in 2,5%iger DMSO-Lösung (Sigma-Aldrich) gelöst. Anti-LYVE-1 (monoklonaler Ratten-Antikörper, 223322, R&D) konjugiert mit Alexa Fluor 647 (Invitrogen) Antikörper (0,75 mg/kg) wurde 12 Stunden vor der Bildgebung intravenös injiziert, um die Lakteale fluoreszierend zu markieren. Anschließend wurde das proximale Jejunum in eine Bildgebungskammer gebracht, in der die Temperatur während der Bildgebung bei 37 °C gehalten wurde. Nach chirurgischer Öffnung des Darmlumens um 1,5 cm entlang der anti-mesenterialen Grenze wurde ein Deckglas auf das freigelegte Lumen gelegt, um eine Zottenansicht zu erhalten. Die intravitale Bildgebung wurde in drei Sitzungen durchgeführt. Die Zotten wurden zunächst vor der BODIPY-FA-Zufuhr bei 0 min abgebildet. Dann wurden 30 μl der BODIPY-Lipidsonden einmal vor der zweiten Bildgebungssitzung zugeführt, um die anfängliche BODIPY-Lipidabsorption bei 1 Minute zu beobachten. Anschließend wurden die BODIPY-Lipide dreimal im Abstand von 2 Minuten vor der dritten Bildgebungssitzung bei 26 Minuten verabreicht, und die BODIPY-FA-Absorption durch die Laktation wurde bei 36 Minuten und 46 Minuten analysiert. Es wurde ein selbstgebautes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop mit Videorate verwendet34. Zwei Dauerstrichlaser, die bei 488 nm (MLD, Coherent) und 640 nm (Cube, Coherent) emittieren, wurden als Anregungsquellen für die Fluoreszenzbildgebung verwendet. Zwei Bandpassfilter (FF01-525/50 und FF01-685/40, Semrock) wurden für den Nachweis von Fluoreszenzsignalen verwendet. Die axiale Auflösung unter 4 μm wurde mit einer 100 μm großen Lochblende und einem 60x-Objektiv (LUMFLN, Wasserimmersion, NA 1,1, Olympus) erfasst. Die Bilder (512 × 512 Pixel) wurden mit einer Bildfrequenz von 30 Hz aufgenommen. Zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses des Bildes wurde das Rauschen über 90 Bilder nach der Nachbearbeitung der Echtzeitbilder (30 Bilder/Sek.) gemittelt, indem die durch die Peristaltik verursachten Bewegungsartefakte mit einem eigens geschriebenen MATLAB-Programm entfernt wurden. Für die Messung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität in der Lamina propria wurde die Software ImageJ (NIH) verwendet.

Lipidabsorptionstest

Nach dem Nahrungsentzug für 12 Stunden wurden 200 μl Olivenöl (Sigma-Aldrich) über eine orale Schlundsonde verabreicht, um die Plasmatriglyceride zu messen und Ölrot O zu färben. 0, 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Verabreichung des Olivenöls wurde eine Blutprobe über die Schwanzvene in ein heparinhaltiges Blutentnahmeröhrchen entnommen. Die Triglyceridkonzentration im Plasma wurde mit einem VetTest Chemistry-Analysegerät (IDEXX Lab) gemessen. Der Dünndarm wurde 12 Stunden nach der Verabreichung von Olivenöl mit Ölrot O angefärbt, wobei das Protokoll des Herstellers des Ölrot O-Färbekits (MAK194, Sigma-Aldrich) befolgt wurde. Die Fütterung mit einer fettreichen Diät (HFD) (60 % kcal Fett, Research Diets, D12492) begann im Alter von 12 Wochen und wurde 8 Wochen lang fortgesetzt, um die Plasmatriglyceride zu messen und die Ölrot-O-Färbung durchzuführen. Die Blutentnahme erfolgte über die Schwanzvene in ein heparinhaltiges Blutentnahmeröhrchen nach 6-stündigem Fasten. Für die Öl-Rot-O-Färbung von Leberschnitten wurde die Leber entnommen, über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA fixiert, in 100 μm große Vibratomschnitte (Leica, VT1200S) geschnitten und mit Öl-Rot-O gefärbt.

Transduktion von AAV

Indizierte Mäuse erhielten eine einzelne i.p. Dosis (1012 Viruspartikel in 150-200 µl) eines rekombinanten AAV, das für die ligandenbindenden Domänen 1-4 von VEGFR3 kodiert und mit der IgG-Fc-Domäne fusioniert ist (AAV-mVEGFR31-4-Ig), und Kontrollmäuse erhielten die gleiche Dosis eines AAV, das für die Domänen 4-7 von VEGFR3 kodiert, die weder VEGF-C noch VEGF-D binden (AAV-mVEGFR34-7-Ig), und mit der IgG-Fc-Domäne fusioniert ist, wie zuvor beschrieben37. AAV-mVEGFR31-4-Ig und AAV-mVEGFR34-7-Ig wurden im Serum durch Immunoblotting-Analyse (Anti-VEGFR3-Antikörper; Ziege polyklonal, AF743, R&D) von 0.5 μl Serumproben, die am selben Tag der Darmanalyse entnommen wurden.

Behandlung mit Antikörper

Für die VEGFR2-Blockade wurde ein VEGFR2-neutralisierender Antikörper (DC101) verwendet. Eine Hybridom-Zelllinie, die DC101 produziert, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben. Die Hybridomazellen wurden in serumfreiem Medium gezüchtet. Die rekombinanten Proteine in den Überständen wurden durch Säulenchromatographie mit Protein-A-Agarosegel (Oncogene) gereinigt. Nach der Reinigung wurden die rekombinanten Proteine mit dem Bradford-Assay quantifiziert und durch Coomassie-Blau-Färbung nach Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bestätigt. DC101 (50 mg/kg) oder eine gleiche Menge des Kontroll-Antikörpers (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) wurde den angegebenen Mäusen 2 Wochen lang alle 2 Tage i.p. injiziert.

Intestinale LEC-Anreicherung und IntSC-Isolierung aus dem Dünndarm

Die Serosa, die Muskelschicht und das Mesenterialfettgewebe wurden aus dem Dünndarm entfernt. Nach dem Öffnen der Darmstücke in Längsrichtung und dem Waschen mit PBS wurden die Proben in 2 cm lange Stücke geschnitten und die Peyerschen Flecken entfernt. Die Proben wurden mit PBS gewaschen und 20 Minuten lang mit 10 mM EDTA in calcium- und magnesiumfreier DMEM (Gibco) auf Eis inkubiert. Die Gewebe wurden mit kalziumfreiem PBS geschüttelt, bis ein klarer Überstand ohne Epithelzellen erhalten wurde. Die Probenstücke wurden weiter in 1 mm große Fragmente geschnitten und mit Dissoziationspuffer, der 2 mg/ml Kollagenase II (Worthington), 1 mg/ml Dispase (Gibco) und 1 U/ml DNase (Invitrogen) in DMEM enthielt, bei 37 °C für 30 Minuten dissoziiert. Um die Dissoziation zu unterstützen, wurden die Gewebestücke alle 10 Minuten vorsichtig auf und ab pipettiert. Die Proben wurden dann durch ein 70-μm-Sieb gefiltert, um die verbleibenden Darmfragmente mechanisch zu zerlegen. Nach dem Auffangen der Überstände wurde ein gleiches Volumen DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) hinzugefügt. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in PBS resuspendiert. Zur Anreicherung der Stromazellfraktion und der LECs wurden hämatopoetische Zellen und Epithelzellen mit AutoMACS (Miltenyi) nach 15-minütiger Inkubation auf Eis mit Anti-CD45 und Anti-CD326 Microbeads (Miltenyi) abgetrennt. Für die Isolierung von IntSCs wurden zusätzlich zu den Anti-CD45- und Anti-CD326-Microbeads Anti-CD31-Microbeads (Miltenyi) hinzugefügt, um Endothelzellen zu entfernen.

Primäre Kultur von Maus-IntSCs

Nach der Isolierung von IntSCs wurden die Zellen in DMEM/F12 mit 10% FBS auf einer Gewebekulturplatte für 24 Stunden oder 2 Tage kultiviert. Für die Medikamentenbehandlung und die Immunfluoreszenzfärbung wurden 50.000 Zellen pro Vertiefung auf Nunc Lab-Tek II Kammern mit 4 Vertiefungen (Sigma-Aldrich) plattiert. Die Medikamentenkonzentrationen sind in den Legenden zu den Abbildungen beschrieben, und die Behandlungen dauerten 6 Stunden für die Immunfluoreszenz- und Genexpressionsanalyse. Für die IntSC-Kultur auf weichen (1,5 kPa) und steifen (28 kPa) Matrizen wurde für 24 h eine 35-mm-Imaging-Schale mit elastisch gelagerter Oberfläche (Ibidi) verwendet. Zur Induktion der Cre-Aktivität in primär kultivierten IntSCs von WT- oder Yap/Tazi∆FRC-Mäusen wurden die Zellen 2 Tage lang mit 5 µM 4-Hydroxy-Tamoxifen (4-OHT) in 100 % Ethanol (EtOH) oder 100 % EtOH allein als Kontrolle behandelt. Für die Experimente wurden kulturerweiterte Monolayer von IntSCs verwendet, die als PDGFRβ+ validiert wurden.

Durchflusszytometrie und Zellsortierung

Um PDGFRβ+ IntSCs oder intestinale LECs zu sortieren, wurden die angereicherten Fraktionen durch Suspension in ACK-Lysepuffer (Gibco) für 5 min bei RT lysiert. Nach Blockierung der Fcγ-Rezeptoren mit Maus-Anti-CD16/CD32 (553141, BD Bioscience) wurden die Zellen 15 Minuten lang mit den angegebenen Antikörpern in FACS-Puffer (2% FBS in PBS) inkubiert. Nach mehreren Waschvorgängen wurden die Zellen mit dem FACS Canto II (BD Biosciences) analysiert und die gewonnenen Daten mit der Software FlowJo (Treestar) ausgewertet. Die Zellsortierung wurde mit dem FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson) durchgeführt. Tote Zellen wurden mit DAPI (Sigma-Aldrich) gefärbt, und Zelldoppelungen wurden systematisch ausgeschlossen. Die Fluoreszenzintensität wird in willkürlichen Einheiten auf einer logarithmischen Skala ausgedrückt, und die Vorwärts- und Seitenstreuung wird auf einer linearen Skala dargestellt. Die folgenden Antikörper wurden für die Durchflusszytometrie verwendet: FITC-Anti-Maus-CD45 (11-0451-85, monoklonale Ratte, Biolegend); FITC-Anti-Maus-TER-119 (11-5921-85, monoklonale Ratte, Biolegend); APC-Anti-Maus-CD31 (551262, monoklonale Ratte, BD Bioscience); und PE/Cy7-Anti-Maus-Podoplanin (127412, monoklonaler syrischer Hamster, Biolegend).

Bulk RNA-Sequenzierung

Die Bulk RNA-Sequenzierung der isolierten PDGFRβ+ IntSCs wurde durch Erhalt der Alignment-Datei durchgeführt. Die Reads wurden mit dem Software-Tool TopHat gemappt. Die Alignment-Datei wurde verwendet, um Transkripte zu assemblieren, ihre Häufigkeit zu schätzen und die differentielle Expression von Genen oder Isoformen mithilfe von Cufflinks zu erkennen. Das Ingenuity Pathway Analysis Tool (QIAGEN) wurde verwendet, um die Daten im Kontext der kanonischen Signalübertragung weiter auszuwerten und festzustellen, ob YAP/TAZ-hyperaktivierte Gene spezifisch mit den sekretorischen Molekülen verbunden sind. Die Signifikanz der kanonischen Signalübertragung wurde mit dem Benjamini-Hochberg-Verfahren getestet, das den P-Wert zur Korrektur von Mehrfachvergleichen anpasst, und ihre Aktivierung oder Hemmung wurde anhand der Aktivierungs-Z-Scores bestimmt. Clusteranalyse und Heatmaps wurden mit Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/) erstellt. Für die GSEA wurden Gensatzsammlungen aus der Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/) verwendet.

MEFs und HDLECs

Mausembryonale Fibroblasten (MEFs) wurden aus E12,5-Embryonen isoliert, wie zuvor beschrieben32. Kopf-, Gliedmaßen- und Herzgewebe wurden entfernt, die Proben mit einer Schere zerkleinert und mit 0,1% Trypsin/EDTA mit DNase (1 U/ml, Invitrogen) bei 37 °C für 20 Minuten verdaut. Nach dem Verdau und der Entfernung von unverdautem Gewebe wurden die Zellen kurz geschleudert, auf eine 10-cm-Schale plattiert und bis zur Subkonfluenz wachsen gelassen. Die MEFs wurden dann in DMEM/F12 mit 10 % FBS gehalten. Humane dermale lymphatische Endothelzellen (HDLECs) wurden von Lonza erworben und in endothelialem Wachstumsmedium (EGM2-MV, Lonza) kultiviert. MEFs und HDLECs wurden in der Passage 2 oder 3 verwendet. Die Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert und als Mykoplasmen-negativ bestätigt (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Spheroid-basierter Sprossungstest

LEC-Sphäroide wurden durch Kultivierung von HDLECs im Stadium 2 oder 3 in Kulturmedium mit 0,25 % Methylcellulose und Inkubation über Nacht als hängende Tropfen36 erzeugt. Die Sphäroide wurden dann entnommen und in 2 mg/ml Kollagen Typ I (Corning) eingebettet und mit Kontroll-Rinderserumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) oder ANGPT2 (5 μg/ml, eigene Herstellung) mit oder ohne VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) in Endothelial Cell Basal Medium (PromoCell) mit 1% FBS für 24 h. Am Ende der Inkubation wurden die Sphäroide mit Cell Tracker (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 min) gefärbt. Die Sphäroide wurden dann in 4% PFA für 15 min bei RT fixiert und mit Cell observer (Carl Zeiss) abgebildet.

Quantitative RT-PCR

RNA wurde mit dem RNeasy Micro Kit (Qiagen) oder dem Trizol RNA Extraktionskit (Invitrogen) extrahiert. Insgesamt 1 µg der extrahierten RNA wurde mit dem GoScript Reverse Transcription Kit (Promega) in cDNA umgeschrieben. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde mit dem FastStart SYBR Green Master Mix (Roche) und dem S1000 Thermocycler (Bio-Rad) mit den angegebenen Primern durchgeführt. Die Primer wurden mit Primer-BLAST entworfen oder aus zuvor veröffentlichten Studien übernommen, die in der ergänzenden Tabelle 1 beschrieben sind. Gapdh wurde als Referenzgen verwendet und die Ergebnisse wurden als relative Expressionen zur Kontrolle dargestellt. Die Spezifität der Primerreaktion wurde durch eine Schmelzkurvenanalyse bestätigt. Die relative Genexpression wurde mit der ΔΔCt-Methode unter Verwendung der CFX Manager Software (Bio-Rad) analysiert.

In vitro Dehnungs- und osmotische Experimente

MEFs und primäre Maus-IntSCs wurden mit einem mechanischen Zelldehnungsinstrument (STREX) mit 4 % linearer Dehnung bei 10 Zyklen/min gedehnt, und osmotischer Stress wurde mit 0,4 M Sorbitol für 3 h wie zuvor beschrieben40,50 angewendet. Die Zellen wurden während aller Experimente in einem befeuchteten 5%-igen CO2-Inkubator bei 37 °C gehalten.

Ex vivo osmotische Experimente

Nach Öffnung der Bauchhöhle unter Narkose wurde der Jejunum-Teil des Dünndarms in 2 cm lange Stücke geschnitten. Die Darmstücke wurden in Längsrichtung geöffnet und mit PBS gewaschen. Die Gewebe wurden dann in DMEM/F12 mit 5 % FBS kultiviert, und es wurde sofort osmotischer Stress mit 0,4 M Sorbitol im Nährmedium für 3 Stunden erzeugt. Die Gewebe wurden während aller Experimente in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten.

Immunfluoreszenzfärbung von MEFs

MEFs wurden auf 8-Well Nunc Lab-Tek II Kammer-Objektträgern (Sigma-Aldrich) plattiert und mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei 4 °C fixiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Proben mit 5%igem Ziegen- (oder Esel-) Serum in 0,5%igem PBST für 30 Minuten bei RT blockiert. Die Zellen wurden mit den angegebenen Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert. Gebundene primäre Antikörper wurden durch Inkubation mit sekundären Antikörpern für 90 Minuten bei RT nachgewiesen. Für die Zellfärbung wurden die folgenden primären Antikörper verwendet: Anti-YAP (monoklonaler Kaninchen-Antikörper, 14074, Cell Signaling); Anti-TAZ (polyklonaler Kaninchen-Antikörper, HPA007415, Sigma-Aldrich); und Alexa Fluor 488-konjugierte Anti-Phalloidin-Antikörper (A12379, Thermo Fisher). Mit Alexa Fluor 594 konjugierte Sekundärantikörper wurden von Jackson ImmunoResearch bezogen. Die Zellkerne wurden mit DAPI (Invitrogen) angefärbt und die Objektträger wie oben beschrieben aufgezogen und abgebildet.

ChIP-qPCR

MEFs wurden mit 1% PFA für 10 Minuten fixiert und mit Glycin gequencht. Die Proben wurden mit PBS gewaschen und mit Lysepuffer, der 1% SDS enthielt, lysiert. Die fixierte DNA in den Zelllysaten wurde mit einem Fokussier-Ultraschallgerät (Covaris) beschallt. Die Zelllysate wurden zentrifugiert, und alle bis auf 5 % (die für die Ganzzell-Lysat-Eingabekontrolle aufbewahrt wurden) der resultierenden Überstände wurden mit ChIP-Verdünnungspuffer mit 0,5 % Triton X-100 verdünnt. Die verdünnten Proben wurden dann über Nacht bei 4 °C mit dem Anti-TEAD4-Antikörper (monoklonaler Maus-Antikörper, ab58310, Abcam) inkubiert. Anschließend wurden Protein A/G Dynabeads (Thermo Fisher) hinzugefügt und die Proben 2 Stunden bei 4 °C inkubiert. Die Beads wurden mit DynaMag-2 (Thermo Fisher) isoliert und mit einer Reihe von ChIP-Waschpuffern gewaschen: salzarmer Waschpuffer, salzreicher Waschpuffer, LiCl-Waschpuffer und TE-Puffer. Die Proben wurden zweimal für jeweils 15 Minuten bei 65 °C in 1%igem SDS eluiert. Die Beads wurden entfernt, und sowohl das eluierte Material als auch die 5 %igen Vollzell-Lysat-Inputproben wurden über Nacht bei 65 °C rückwärts vernetzt. Nach Normalisierung des pH-Werts wurden die Proben 30 Minuten lang mit RNase (3 μg/ml) bei 37 °C und 2 Stunden lang mit Proteinase K (20 mg/ml) und Glykogen (20 mg/ml) bei 55 °C inkubiert. Die DNA wurde nach Standardverfahren eluiert, und die ChIP-DNA wurde mittels qPCR im Vergleich zu den Eingangsproben unter Verwendung der in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführten Primer analysiert.

ELISA

Der Überstand von primär kultivierten Maus-IntSCs wurde nach dem Dehnen geerntet, und der Überstand wurde 15 Minuten lang zentrifugiert. Die VEGF-C-Konzentration im Überstand wurde durch einen Enzymimmunoassay (ELISA) mit einem Maus-VEGF-C-spezifischen ELISA-Kit (CSB-E07361m, Cusabio) gemessen.

Morphometrische Analyse

Morphometrische Messungen wurden mit der ImageJ-Software (NIH), der ZEN 2012-Software (Carl Zeiss) oder Imaris (Bitplane) durchgeführt. Für die Quantifizierung der Milchzottenoberfläche wurde ein Schwellenwert für die zu analysierenden Bilder festgelegt und die absolute LYVE-1+-Zottenfläche für jede Milchzotte innerhalb der Zotte gemessen. Die absolute Länge der Milchzotten, die absolute Länge der Zotten und die absolute Breite der Zotten wurden anhand der Bilder der E-Cadherin+- oder CD31+- oder LYVE-1+-Immunfärbung der Zotten in jedem zufälligen 850-µm2-Feld des angegebenen Teils des Darms gemessen. Für die Quantifizierung der Laktat- und Zottenoberfläche, Länge und Breite wurden mindestens 100 Zotten im gesamten Dünndarm analysiert. Die Quantifizierung der folgenden Parameter im Dünndarm wurde im Jejunum durchgeführt. Die Anzahl der Laktatsprossen und die Anzahl der Laktatverzweigungen wurden in 10-20 zufällig ausgewählten LYVE-1+ Laktaten gemessen. Die Anzahl der Prox1+ LECs und die Anzahl der Prox1+EdU+ LECs wurden manuell innerhalb von 100 μm Länge von 10-20 zufälligen LYVE-1+ Lakteal gezählt. Die Quantifizierung der VE-Cadherin+-Verbindungen der Lakteal wurde mit einem ×40-Objektiv in Lakteal von 5-10 Zotten pro Maus durchgeführt. Kurz gesagt, wurden reißverschlussartige Verbindungen als kontinuierliche Verbindungen an Zell-Zell-Grenzen mit Zellen, die eine längliche Form haben, definiert51. Knopfförmige Übergänge wurden als diskontinuierliche Übergänge definiert, die nicht parallel zu den Zell-Zell-Grenzen verlaufen und eine eichenblattartige Zellform aufweisen. Übergänge, die keinem der beiden Muster entsprechen, wurden als gemischter Typ kategorisiert. Die Fluoreszenzintensität (FI) von BODIPY und deren Quantifizierung wurde wie zuvor beschrieben34 durchgeführt. Die Öl-Rot-O-Fläche wurde als Öl-Rot-O+-Fläche geteilt durch die Zottenfläche gemessen und auf den Durchschnitt der Fläche von Kontrollmäusen normiert. Die Fläche der glatten Muskelzellen in den Zotten wurde als absolute αSMA+-Fläche in fünf 850-µm2-Feldern pro Probe gemessen, die dann auf den Durchschnitt der Kontrollmäuse normiert wurde. Zur Quantifizierung der relativen Ausprägung des laktischen VEGFR3 wurde der mittlere FI in fünf 425 µm2 großen Feldern pro Probe gemessen und als relative Werte dividiert durch die Kontrollwerte dargestellt. Zur Bestimmung der Blutgefäßdichte wurde die Fläche von VEGFR2 in fünf 425-µm2-Feldern pro Probe gemessen und als relative Werte zur Kontrolle dargestellt. Die Fläche von CD3+ T-Zellen oder F4/80+ Makrophagen wurde in fünf 425 µm2 großen Feldern pro Probe gemessen. Die Dichte der Lymphgefäße wurde durch Messung der LYVE-1+-Fläche in fünf zufälligen 425-850 µm2-Feldern von Ganzkörperproben berechnet und als relative Werte zur Kontrolle angegeben.

Tropfenbasierte Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Sortierte Einzelzellen wurden mit dem 10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) gemäß den Herstellerprotokollen verarbeitet. Die sortierten Zellen wurden in PBS mit 0,5 % BSA resuspendiert und mit dem RT-Reagenzienmix und dem RT-Primer gemischt, die dann in jeden Kanal des 10X-Chips gegeben wurden, um 5000 Zellen zu erfassen. Die Zellen wurden in Gel-Beads in Emulsion separiert, wo die RNA-Transkripte der einzelnen Zellen mit einem Barcode versehen und revers transkribiert wurden. Nach dem Aufbau der cDNA-Bibliothek und der Amplifikation wurden die cDNA-Moleküle enzymatisch fragmentiert, am Ende repariert und mit A-Schwänzen versehen. Nach Auswahl der geeigneten Größe der prozessierten cDNA-Moleküle durch doppelte Größenselektion mit SPRI-Beads (Beckman Coulter) wurden sie mit einem Adapter ligiert, und es wurde eine Probenindex-PCR durchgeführt. Nach einer weiteren doppelten Größenselektion mit SPRI-Beads wurden die endgültigen Bibliothekskonstrukte 10-fach verdünnt und zur Qualitätskontrolle auf dem Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip ausgeführt. Die Einzelzellbibliotheken wurden dann mit der Illumina HiSeq-X-Plattform sequenziert.

Vorverarbeitung der Einzelzell-RNA-Daten

Die Rohdaten der Sequenzierung wurden zunächst de-multiplexiert und mit dem Cell Ranger 3.0.2 Toolkit von 10X Genomics (http://10xgenomics.com) auf das Maus-Referenzgenom (mm10) abgebildet. Mithilfe des R-Pakets Seurat (Version 3.0.0)52 wurden mit der Read10X-Funktion rohe Ausdrucksmatrizen erstellt. Zellen mit weniger als 1000 entdeckten Genen oder mehr als 6000 entdeckten Genen (die als potenzielle Doubletten betrachtet wurden) wurden ausgeschlossen (ergänzende Abb. 17a). Darüber hinaus wurden Zellen mit einer hohen Anzahl an mitochondrialen Genen, die mit einem einzigartigen molekularen Identifikator (UMI) assoziiert sind (>7 % der Gesamtzahl), als tote Zellen betrachtet und daher ausgeschlossen. Bei den Genen wurden diejenigen entfernt, die von weniger als 3 Zellen exprimiert wurden. Darüber hinaus wurde eine kleine Anzahl kontaminierender Ptprc+ Immunzellen und Pecam1+ Cdh5+ Endothelzellen nach der ersten Runde der Clusterbildung ausgeschlossen. Nach dem Entfernen unerwünschter Zellen und Gene wurden die UMI-Zahlen für jedes Gen einer Zelle durch die Gesamtexpression einer bestimmten Zelle geteilt, mit 10.000 multipliziert und log-transformiert. Anschließend wurden die Gene skaliert und zentriert, indem Variablen wie der prozentuale Anteil mitochondrialer Gene und die Anzahl der UMIs herausgerechnet wurden.

Identifizierung variabler Gene und Dimensionalitätsreduktion

Das R-Paket Seurat wurde für die Clusteranalyse verwendet. Zunächst wurden hochvariable Gene im gesamten Datensatz mit der Funktion FindVariableFeatures in Seurat mit der Option: selection.method = „vst“ identifiziert. Die 2000 Gene mit der höchsten Variabilität wurden für die nachfolgende Analyse ausgewählt. Unter Verwendung der identifizierten variablen Gene wurde eine erste Dimensionalitätsreduktion mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt. Die JackStraw-Funktion wurde zur Bestimmung der statistischen Signifikanz der PCA-Ergebnisse verwendet. Die 30 signifikantesten Hauptkomponenten (PCS) wurden als Input für die Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) verwendet, um die Daten in den zweidimensionalen Raum zu reduzieren.

Cluster-Analyse

Um die Zellen nach ihren Transkriptionsprofilen zu clustern, führten wir ein unüberwachtes Clustering der 2000 wichtigsten hochvariablen Gene für alle vier Proben durch. Zunächst erstellten wir mit der Funktion FindNeighbors einen gemeinsamen Graphen der nächsten Nachbarn (SNN) im Hauptkomponentenraum. Dann wurde der Louvain-Algorithmus für ein auf Modularitätsoptimierung basierendes Clustering mit der Funktion FindClusters angewendet. Die Parameter für die Clustering-Auflösung wurden an dem Punkt festgelegt, an dem die Cluster sehr unterschiedliche Transkriptionsprofile aufwiesen. Die Clusterung war unabhängig von der Anzahl der pro Zelle entdeckten Gene (siehe ergänzende Abb. 17b). Clusterspezifische Marker waren differenziell exprimierte Gene für jeden Cluster, die durch die FindMarkers-Funktion in Seurat mit den folgenden Einstellungen identifiziert wurden: min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15, test.use = „MAST“. Identifizierte Marker mit einem angepassten P < 0,05 wurden für die weitere Analyse verwendet. Da einige Zelltypen wie glatte Muskelzellen und Muralzellen über bekannte Marker verfügten, bestätigte ihr Auftauchen an der Spitze der Markerliste für jeden Cluster unsere Markerauswahlverfahren. Um unerwünschte Variationsquellen wie das Geschlecht zu entfernen, wurden die Zellen nach dem Vorhandensein des frauenspezifischen Transkripts Xist aufgeteilt und integriert. Um die Integration verschiedener Datensätze durchzuführen, haben wir zunächst die rohen Expressionsmatrizen logarithmisch normalisiert und die 2000 wichtigsten hochvariablen Gene für jeden Datensatz identifiziert. Dann identifizierten wir mit der Funktion FindIntegrationAnchors in Seurat die Anker zwischen den Datensätzen. Anschließend wurden die Datensätze auf der Grundlage der identifizierten Anker mit der Funktion IntegrateData in Seurat integriert. Die integrierten Datensätze wurden dann skaliert und die Dimensionen wurden für die weitere Clusteranalyse reduziert. Die Cluster in den integrierten Datensätzen wurden anhand der Expressionsprofile der Gene in den identifizierten Maker-Listen annotiert.

Gene Ontologie-Anreicherungsanalyse

Die Analyse der Anreicherung von Clustermarkern mit Hilfe von R-Paket goseq (Version 1.34.0)53 wurde mit Hilfe der Gene Ontologie durchgeführt. Abhängig von der Länge des Gens wurden Gewichtungen für jedes Gen ermittelt und die Wallenius-Approximation wurde verwendet, um assoziierte Gen-Ontologie-Terme zu identifizieren. Es wurden Gen-Ontologie-Begriffe mit einem bereinigten P < von 0,05 und biologische Prozesskategorien ausgewählt.

Statistik

Es wurden keine statistischen Methoden verwendet, um die Stichprobengröße vorher zu bestimmen. Die Experimente wurden nach dem Zufallsprinzip durchgeführt, und die Prüfer waren während der Experimente und der Ergebnisanalysen hinsichtlich der Zuteilung verblindet. Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Signifikanz wurde durch den zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test zwischen zwei Gruppen oder durch die zweiseitige ANOVA mit Holm-Sidak’s multiplem Vergleichstest für den Vergleich mehrerer Gruppen bestimmt. Die statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software) durchgeführt. Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.