Úřad pro kontrolu potravin a léčiv v USA

ITG SUBJECT: PYROGENY, STÁLE NEBEZPEČNÉ

Úvod

Příchod podkožní jehly poskytl nový způsob podávání léků. \Podle dnešních měřítek však byly první parenterální \a)\ léky surové a nebezpečné, protože zvýšené používání těchto prvních injekčních roztoků přineslo jejich průvodní jevy v podobě infekcí, nežádoucích účinků léků, horeček neznámé etiologie a dokonce i úmrtí na šok. Pro první pracovníky v oboru mikrobiologie bylo matoucí, že i při injekčním podání sterilních roztoků docházelo k ojedinělým horečkám.

Moderní injekční roztoky jsou bezpečnější, přesto se v literatuře stále objevují zprávy o nežádoucích reakcích. V tomto čísle se s vámi podělíme o obavy pacientů, kteří nemohou přijímat tekutiny ústy z důvodu chirurgického zákroku nebo některých druhů onemocnění a kteří by mohli nést následky nežádoucích toxinů, o nichž je známo, že jsou látkami vyvolávajícími horečku, pokud jsou v parenterálním přípravku přítomny. Doufáme, že ukážeme přínos toho, co se v této oblasti zjistilo.

Historie – pyrogeny

V druhé polovině 19. století bylo známo, že některé parenterální roztoky způsobují výrazné zvýšení tělesné teploty. Původci vyvolávající horečku nebyli známi. Nemoci způsobené touto „horečnatou látkou“ byly různě popisovány mimo jiné jako „horečka z injekcí“, „horečka z destilované vody“ a „horečka z fyziologického roztoku“. Dnes jsou bakteriální pyrogeny \b)\ považovány za původce mnoha prvních horeček a mnoha dalších biologických účinků popsaných při parenterální terapii. Z toho můžeme pochopit, proč je třeba při přípravě a používání injekčních roztoků věnovat maximální pozornost vyloučení skrytého pyrogenu.

Přirozená obrana a pyrogeny

Jako zdraví lidé vystavení univerzálnímu rozšíření mikrobů v prostředí koexistujeme s mikrobiálním světem. Za normálních okolností přirozená obrana organismu omezuje mikroby a jejich metabolity (toxiny atd.) na místa, kde je lze tolerovat, například na kůži a v trávicím traktu. Parenterální cesta podání léku umožňuje pyrogenu, pokud je přítomen, obejít běžnou obranyschopnost organismu. Reakce hostitele je zprostředkována leukocyty (bílými krvinkami), které následně uvolňují vlastní druh pyrogenu (endogenní pyrogen) a ten zase iniciuje horečnatou reakci a množství dalších biologických reakcí.

Biologické účinky endotoxinů

Široká škála biologických účinků připisovaných bakteriálním pyrogenům vzbudila značný zájem. \3\, \4\ Předpokládá se, že reakce hostitele na pyrogeny budou patřit do následujících kategorií:

Horečka je dobře známý účinek, proto se používá termín „pyrogen“. Přibližně jednu hodinu po injekci pyrogenů králíkům (nebo člověku) dochází ke zvýšení tělesné teploty. Pokud jsou bakteriální pyrogeny injikovány v dostatečném množství, třeba v mikrogramových množstvích, je vyvolaná horečka doprovázena zimnicí, bolestmi těla, vzestupem krevního tlaku a případně i šokovým stavem a smrtí. Z menších injekčních množství se v těle projeví zvýšená kapilární propustnost a celá řada dalších oběhových změn. Příkladem těchto změn je snížení a následné zvýšení počtu bílých krvinek, nádorové krvácení a změny žilních tlaků.

Ve zvláštních případech mohou pyrogeny vykazovat Shwartzmanův fenomén. Jedná se o závažnou krvácivou reakci s lokalizovanou nekrózou. Lze ji demonstrovat na králíkovi, kterému je nejprve subkutánně aplikován bakteriální pyrogen a o 24 hodin později je mu stejný pyrogen aplikován intravenózně. Místo pozdější injekce se v centru zbarví do modra a na periferii do červena.

Tolerance k pyrogenu je další důležitou reakcí, která vzniká při opakovaném podávání injekcí pyrogenu zvířatům. Vyvine se snížená citlivost na stejný a další pyrogeny, která anuluje febrilní reakci a vyžaduje, aby bylo tolerantní zvíře vyřazeno z dalšího testování pyrogenů. „Citlivost“ znamená, že zvíře reaguje na minimální množství pyrogenního materiálu. Ačkoli je nejčastěji používaným testovacím zvířetem králík, za nejcitlivějšího na pyrogeny je považován člověk.

Bakteriální toxiny

Existují dva obecné druhy bakteriálních toxinů. \Exotoxiny vznikají během růstové fáze určitých druhů bakterií a uvolňují se do média nebo tkáně. Exotoxiny jsou bílkovinné povahy a jejich reakce jsou specifické. Například Clostridium botulinum produkuje exotoxin neobvyklé síly, který ovlivňuje pouze neurologickou tkáň. Dalšími známými příklady exotoxinů jsou tetanový toxin, Shiga toxin a difterický toxin.

Endotoxiny jsou dalším druhem toxinu, který lze získat z celé řady gramnegativních bakterií. Termín „endotoxin“ je obvykle zaměnitelný s termínem „pyrogen“, ačkoli ne všechny pyrogeny jsou endotoxiny a samotné testování pyrogenů nelze pro detekci a charakterizaci mikrobiálních endotoxinů zcela použít. K vyvolání smrtelného účinku u pokusného zvířete jsou zapotřebí vyšší dávky endotoxinu než u exotoxinů. Účinky endotoxinů na hostitele jsou spíše systémové, jako je horečka a celkové tělesné reakce, než čistě neurologické účinky, jako je tomu u většiny exotoxinů. Endotoxiny se vyskytují převážně u gramnegativních bakterií a vznikají po smrti a autolýze buněk. Endotoxiny se získávají z buněčné struktury (buněčné stěny) a jsou s ní spojeny. Dobrými příklady bakterií produkujících pyrogeny jsou S. typhosa, E. coli a Ps. aeruginosa.

Další vlastnosti pyrogenů

Při výčtu dalších vlastností lze říci, že pyrogeny: (1) je známo, že biochemicky se skládají z lipid-polysacharid-peptidové látky; (2) jsou tepelně stabilní při teplotě vroucí vody; (3) jsou relativně málo akutně toxické pro člověka; (4) vykazují nízký řád imunitní odpovědi a (5) mohou být produkovány z perzistentních gramnegativních bakterií, které by mohly mít 50% úmrtnost. \6\

Lékaři jsou poučeni o tom, že mají okamžitě pátrat po příčině perzistujících bakteriémií. Možným zdrojem může být febrilie v místě katétru, infuzní zařízení nebo parenterální roztok. Je zajímavé, že léčba pacientů v pyrogenním šoku zahrnuje podávání parenterálních tekutin (doufejme, že nepyrogenních).

Udělejte to bez pyrogenů

Baktericidní postupy, jako je zahřívání, filtrace nebo adsorpční techniky, neodstraňují pyrogeny z parenterálních roztoků. Všechny složky musí být v první řadě bez pyrogenů. Pro toto zajištění výrobce provádí komplexní screeningové testy pyrogenů u všech složek parenterálních léčiv a dbá na jejich správné skladování před použitím. V ideálním případě výrobce rozpozná kritické kroky ve výrobních operacích, které by mohly umožnit růst bakterií produkujících pyrogeny, a tyto oblasti rutinně monitoruje. Například voda v zásobních nádržích by měla být testována na přítomnost pyrogenů a výrobce by měl trvat na minimální době uchovávání, aby se používala pouze voda bez pyrogenů. Voda bez pyrogenů, jako „voda na injekci“ popsaná v USP, je srdcem parenterálního průmyslu.

Test na pyrogeny – USP

Současný USP jasně popisuje test na pyrogeny. USP XIX považuje roztok za pyrogenní, pokud je 10 m1/kg podáno králíkovi a dojde ke zvýšení teploty o 0,6 C nebo více u kteréhokoli králíka nebo k celkovému zvýšení teploty o více než 1,4 C u tří králíků v testovací skupině tří králíků. Zvládnutí oficiální metody na králících vyžaduje značný čas, náklady, školení a zkušenosti. Existuje jen málo zkratek. Důsledkem netestování na přítomnost pyrogenů mohou být ještě vyšší náklady v podobě reakcí pacientů a stahování léků z trhu.

Test na přítomnost pyrogenů – Limulus Amoebocyte Lysate

Mnoho laboratoří provádí testy na přítomnost pyrogenů pomocí testovací metody Limulus Amoebocyte Lysate (LAL). \7\ Metoda LAL je užitečná zejména pro screening výrobků, které je nepraktické testovat králičí metodou. Výrobky, které se nejlépe testují na endotoxiny metodou LAL, jsou: radiofarmaka, anestetika a mnoho biologických látek. Metoda LAL v podstatě spočívá v reakci hemolymfy (krve) kraba podkováře (limulus polyphemus) s endotoxinem za vzniku gelu. Množství endotoxinu, který geluje, se určuje pomocí ředicích technik porovnávajících tvorbu gelu testovaného vzorku s tvorbou gelu referenčního pyrogenu nebo pomocí spektrofotometrických metod porovnávajících neprůhlednost tvorby gelu testovaného vzorku s neprůhledností referenčního pyrogenu. LAL test je považován za specifický pro přítomnost endotoxinů a je nejméně stokrát citlivější než králičí test. \8\, \9\ Metodou LAL lze prokázat i pikogramová množství endotoxinů. Ačkoli je LAL relativně novou metodou testování pyrogenů, byla prokázána široká škála polysacharidových derivátů, které poskytují pozitivní výsledky limulového testu a rovněž vykazují horečnatou aktivitu. Je také skutečností, že některé látky interferují s testem LAL, i když jsou pyrogeny přítomny.

Některé firmy používají test LAL pro screening pyrogenů v surovinách a následně testují pyrogeny na konečném výrobku pomocí králičího testu USP. Test LAL na pyrogeny v léčivých přípravcích vyžaduje změnu NDA na základě individuálního výrobku. Reagencie pro test LAL jsou licencovány Úřadem pro biologické přípravky. U prostředků musí mít firma protokol schválený ředitelem Úřadu pro zdravotnické prostředky, než může nahradit králičí test testem LAL. \Budoucnost testů LAL se zdá být slibná v tom, že se uvažuje o jejich zařazení do USP, ale v současné době se nejedná o oficiální metodu.

Jisté je, že pyrogeny zůstávají potenciálním zdrojem nebezpečí při používání parenterální terapie. Úplné vyloučení pyrogenů vyžaduje náš trvalý dohled ve vztahu k výrobě parenterálních léčiv. \a)\Parenterální (para = mimo; enteron = střevo) Ne přes trávicí trakt, ale jinou cestou, např. subkutánní, intramuskulární, intravenózní, intraspinální apod.

\b)\Pyrogen – látka bakteriálního původu vyvolávající horečku; endotoxin. Dorlandův ilustrovaný lékařský slovník. 25. E.W.B. Saunders, Philadelphia.

1. Singer, Charles Joseph; Underwood, Edgar Ashworth. Stručné dějiny medicíny. 2nd Ed., 1962. Oxford Univ. Press, NY, and Oxford.
2. Hindman, S. H. et al. „Pyrogenic Reactions During Haemodialyzing Caused by Endotoxin“. Lancet 2 (7938): 732-4, 18. října 1975.
3. Kadis, Solomon; Weinbaum, George; Ajl, Samuel J.; Microbial Toxins Vol. IV & V. 1971 Academic Press, NY & London.
4. Davis, Bernard E., et al. Endotoxiny: Učebnice mikrobiologie, str. 615-7. Čtvrté vydání. Hoeber Medical Division. Harper & Row Publishers, NY.
5. Stainer, Roger Y.; Doudoroff, Michael; Adelberg, Edward A. The Microbial World, Prentice Hall, Inc. 3. vyd, 1970.
6. Krupp, Marcus A. & Chatton, Milton J.; Current Medical Diagnosis and Treatment. str. 775, Lange Medical Publications, 1975, Los Altos, CA
7. Rastogi, S. C.; Hochstein, H. D.; Seligman, E. B. Jr; „Statistical Determination of Endotoxin Content in Influenza Virus Vaccine by the Limulus Amoebocyte Lysate Test“. J. Clin Microbiol 6(2): 144-8, Aug. 1977.
8. Nandan, R.; Nakashima, C. Y., Brown, D. R.; „Detection of Endotoxins in Human Blood and Plasma“. An improved in-vitro pyrogen test. Clin Chem 23(11): 2080-4 Nov. 1977.
9. Wachtel, R. E.; Tskji, K.; „Comparison of Limulus Amoebocyte Lysates and Correlation with the USP Pyrogen Test“. Appl. Environ. Microbiology 33(6) 1265-9, June 1977.
10. Docket No. 77N-0282 as found in FR Doc. 77-31926 Soubor 11-3-77 (svazek 42, č. 213 — pátek 4. listopadu 1977) a jak se nachází ve FR Doc. 78-623 založené 1-12-78 (svazek 43, č. 9 — pátek 3. ledna 1978)