Před dostupností počítačů vyžadovalo stanovení hodnot KM a Vmax algebraickou manipulaci se základní Michaelis-Mentenovou rovnicí. Protože se Vmax blíží asymptoticky (viz obrázek 8.11), nelze z typického Michaelis-Mentenova grafu získat definitivní hodnotu. Protože KM je koncentrace substrátu při Vmax/2, je podobně nemožné určit přesnou hodnotu KM. Vmax však lze přesně určit, pokud se Michaelisova-Mentenova rovnice převede na rovnici, která poskytuje přímkový graf. Vezmeme-li reciprokou hodnotu obou stran rovnice 23, dostaneme
Kresba závislosti 1/V0 na 1/, nazývaná Lineweaverův-Burkův nebo dvojitě reciproký graf, dává přímku s průsečíkem 1/Vmax a sklonem KM/Vmax (obrázek 8.36). Průsečík na ose x je -1/KM.
Obrázek 8.36
Dvojitý reciproký nebo Lineweaverův-Burkův graf. Dvojitý reciproký graf enzymové kinetiky vznikne vynesením 1/V0 jako funkce 1/. Sklon je KM/Vmax, průsečík na svislé ose je 1/Vmax a průsečík na vodorovné ose (více…)
Dvojité reciproké grafy jsou užitečné zejména pro rozlišení kompetitivních a nekompetitivních inhibitorů. Při kompetitivní inhibici je intercept na ose y grafu 1/V0 versus 1/ stejný v přítomnosti i v nepřítomnosti inhibitoru, ačkoli sklon se zvyšuje (obrázek 8.37). To, že se intercept nemění, je způsobeno tím, že kompetitivní inhibitor nemění Vmax. Při dostatečně vysoké koncentraci jsou prakticky všechna aktivní místa zaplněna substrátem a enzym je plně funkční. Zvýšení sklonu grafu 1/V0 versus 1/ ukazuje na sílu vazby kompetitivního inhibitoru. V přítomnosti kompetitivního inhibitoru se rovnice 31 nahradí rovnicí
ve kterém je koncentrace inhibitoru a Ki je disociační konstanta komplexu enzym-inhibitor.
Obrázek 8.37
Konkurenční inhibice znázorněná na dvojnásobně reciprokém grafu. Dvojitý reciproký graf kinetiky enzymu v přítomnosti (
)a nepřítomnosti (
) kompetitivního inhibitoru znázorňuje, že inhibitor nemá vliv na Vmax, ale zvyšuje KM.
Jinými slovy, v přítomnosti kompetitivního inhibitoru se sklon grafu zvyšuje o faktor (1 + /Ki). Uvažujme enzym s KM 10-4 M. V nepřítomnosti inhibitoru je V0 = Vmax/2, když = 10-4 M. V přítomnosti 2 × 10-3 M kompetitivního inhibitoru, který je vázán na enzym s Ki 10-3 M, bude zdánlivá KM (KappM ) rovna KM × (1 + /Ki), neboli 3 × 10-4 M. Dosazením těchto hodnot do rovnice 23 získáme V0 = Vmax/4, když = 10-4 M. Přítomnost kompetitivního inhibitoru tedy při této koncentraci substrátu snižuje rychlost reakce na polovinu.
Při nekompetitivní inhibici (obr. 8.38) se inhibitor může spojit buď s enzymem, nebo s komplexem enzym-substrát. Při čisté nekompetitivní inhibici jsou hodnoty disociačních konstant inhibitoru a enzymu a inhibitoru a komplexu enzym-substrát stejné (kapitola 8.5.1). Hodnota Vmax se sníží na novou hodnotu nazvanou Vappmax, a tím se zvýší intercepce na svislé ose. Nový sklon, který se rovná KM/Vappmax, je větší o stejný faktor. Na rozdíl od Vmax není KM ovlivněna čistě nekompetitivní inhibicí. Maximální rychlost v přítomnosti čistého nekompetitivního inhibitoru, Vimax, je dána vztahem
Obrázek 8.38
Nekonkurenční inhibice znázorněná na dvojitém reciprokém grafu. Dvojitý reciproký graf kinetiky enzymu v přítomnosti (
) a nepřítomnosti (
) nekompetitivního inhibitoru ukazuje, že KM se nemění a Vmax se snižuje.