Odlišné podskupiny fibroblastů regulují integritu mléčné žlázy prostřednictvím YAP/TAZ-indukovaného VEGF-C ve střevních klcích

Experimentální zvířata

Veškerá péče o zvířata a experimentální postupy byly v souladu se všemi etickými předpisy pro výzkum a testování na zvířatech na základě schválení Institucionální komise pro péči o zvířata a jejich použití (č. 1). KA2016-12) Korejského pokročilého institutu vědy a technologie (KAIST). Myši Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 a Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 byly přeneseny, založeny a chovány v zařízeních pro zvířata bez specifických patogenů (SPF) v KAIST. Myši C57BL/6 J, R26-tdTomato a Myh11-Cre-ERT2 byly zakoupeny v Jackson Laboratory. Všechny myši byly chovány na pozadí C57BL/6 a byly krmeny volným přístupem ke standardní stravě (PMI LabDiet) a vodě. Za účelem indukce aktivity Cre u myší Cre-ERT2 byly v uvedených časových bodech každého experimentu intraperitoneálně (i.p.) aplikovány 2 mg tamoxifenu (Sigma-Aldrich) rozpuštěného v kukuřičném oleji (Sigma-Aldrich). Cre-ERT2 negativní, ale flox/flox pozitivní myši mezi vrstevníky byly definovány jako kontrolní (WT) myši pro každý experiment. Myši byly před usmrcením anestetizovány i.p. injekcí kombinace anestetik (80 mg/kg ketaminu a 12 mg/kg xylazinu).

Histologické analýzy

Pro celoplošné barvení tenkého střeva byla po anestezii provedena transkardiální perfuze 2% paraformaldehydem (PFA). Tenké střevo bylo odebráno a podélně rozříznuto, aby se odkrylo lumen. Po několikerém promytí PBS byla střeva připevněna na křemíkové destičky. Vzorky byly následně fixovány při 4 °C ve 4% PFA po dobu 2 h. Vzorky byly několikrát promyty PBS a následně dehydratovány 10% sacharózou v PBS po dobu 2 h a 20% sacharózou, 10% glycerolem v PBS přes noc. Kůže ucha, průdušnice a bránice byly odebrány bez transkardiální perfuze a fixovány ve 4% PFA po dobu 1 h při 4 °C. Vzorky byly před blokováním několikrát promyty PBS. Po blokování 5% kozím nebo oslím sérem v 0,5% Triton-X 100 v PBS (PBST) po dobu 1 h byly vzorky inkubovány s uvedenými primárními protilátkami zředěnými v blokovacím roztoku při 4 °C přes noc. Po několikerém promytí PBST byly vzorky inkubovány 2 h při pokojové teplotě (RT) s uvedenými sekundárními protilátkami konjugovanými s fluorokromem a zředěnými v blokovacím roztoku. Vzorky byly promyty PBST a jádra byla obarvena pomocí DAPI (Invitrogen). Po promytí PBS byly vzorky upevněny pomocí Vecta-shield (Vector Laboratories). Snímky byly získány pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 800 nebo LSM 880 (Carl Zeiss).

Při imunoznačení byly použity následující primární a sekundární protilátky: anti-LYVE-1 (králičí polyklonální, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (potkaní monoklonální, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (křeččí monoklonální, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-cadherin (kozí polyklonální, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (kozí polyklonální, AF2727, R&D, 1:400); anti-Prox1 (králičí polyklonální, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anti-VE-cadherin (kozí polyklonální, AF1002, R&D, 1:200); anti-PDGFRβ (potkaní monoklonální, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (myší monoklonální, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (kozí polyklonální, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (králičí monoklonální, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (králičí polyklonální, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (králičí polyklonální, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (králičí polyklonální, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (kozí polyklonální, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (králičí polyklonální, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (kozí polyklonální, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (králičí monoklonální, 14074, Cell signaling, 1:200); anti-TAZ (králičí polyklonální, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-αSMA, konjugovaný s fluorescein-izothiokyanátem (FITC) (myší monoklonální, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (kozí polyklonální, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (kozí polyklonální, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (králičí monoklonální, 13179, Cell signaling, 1:400); anti-F4/80, konjugovaná s FITC (potkaní monoklonální, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (křeččí monoklonální, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmin (králičí polyklonální, AB907, Millipore, 1:400); a sekundární protilátky proti králíkům, potkanům, kozám a křečkům konjugované s Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 a Alexa Fluor 647 (ředěné v poměru 1 : 1000) byly zakoupeny od společnosti Jackson ImmunoResearch. Všechny protilátky použité v naší studii byly validovány pro daný druh a aplikaci.

Jednomolekulární fluorescenční hybridizace in situ (smFISH)

Pro smFISH tenkého střeva byla po anestezii provedena transkardiální perfuze 2% PFA. Vzorky byly postfixovány při 4 °C ve 4% PFA po dobu 2 h. Vzorky byly několikrát promyty PBS, přemístěny do 30% sacharózy a inkubovány přes noc. Vzorky zalité v OCT byly rozřezány a provedli jsme smFISH podle protokolu výrobce, který je popsán v sadě RNAscope Fluorescent Multiplex Assay (320850, ACDBio). Pro smFISH byla použita sonda RNA scope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2). Při imunobarvení pomocí smFISH byly použity následující primární a sekundární protilátky: anti-PDGFRβ (potkaní monoklonální, ab91066, Abcam); anti-Shisa3 (králičí polyklonální, TA320118, Origene); anti-P2X1 (králičí polyklonální, APR-001, Alomone labs) a sekundární protilátky konjugované s Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647 byly zakoupeny od společnosti Jackson ImmunoResearch. Snímky byly získány pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 800 nebo LSM 880 (Carl Zeiss).

EdU incorporation assay for proliferating LECs

Pro detekci proliferujících LEC v mléčné liště bylo 5 mg 5-ethynyl-2′-deoxyuridinu (EdU, A10044, Invitrogen) rozpuštěno v 1 ml vody Milli-Q jako zásobní roztok. Poté bylo každý druhý den po dobu jednoho týdne před analýzou aplikováno i.p. 200 μl základního roztoku na myš. Tenké střevo bylo izolováno a zpracováno, jak je popsáno výše. Buňky inkorporované EdU byly detekovány pomocí soupravy Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) podle protokolu výrobce.

Elektronová mikroskopie

Pro pořízení ultrastrukturních elektronmikroskopických snímků mléčné žlázy bylo tenké střevo rozřezáno po transkardiální perfuzi 4% PFA a 0,25% glutaraldehydem v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 7,4). Vzorky byly poté přes noc fixovány v 2,5% glutaraldehydu, postfixovány 1% tetroxidem osmia a dehydratovány sérií zvyšujících se koncentrací ethanolu s následným zalitím do pryskyřice. Pomocí ultramikrotomu (UltraCut-UCT, Leica) byly získány ultratenké řezy mléčnou žlázou o velikosti 70 nm, které byly následně odebrány na měděné mřížky. Vzorky byly zobrazeny transmisní EM (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) při 120 kV po obarvení 2% uranylacetátem a citrátem olovnatým.

Intravitální zobrazování clearance lipidů z lamina propria

Myši byly před zákrokem 12 hodin anestetizovány po odstranění potravy. Intravitální zobrazování bylo provedeno tak, jak jsme již dříve popsali34. Stručně řečeno, lipidové sondy BODIPY (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) byly rozpuštěny v 2,5% roztoku DMSO (Sigma-Aldrich). Protilátka anti-LYVE-1 (monoklonální protilátka proti potkanovi, 223322, R&D) konjugovaná s protilátkou Alexa Fluor 647 (Invitrogen) (0,75 mg/kg) byla intravenózně aplikována 12 h před zobrazením pro fluorescenční značení mlékovodů. Poté bylo proximální jejunum exteriorizováno v zobrazovací komoře, kde byla během zobrazování udržována teplota 37 °C. Po chirurgickém otevření střevního lumen 1,5 cm podél antimezenteriální hranice bylo na obnažené lumen umístěno krycí sklo pro získání pohledu na klky. Intravitální zobrazování bylo provedeno během tří sezení. Nejprve byly zobrazeny klky před podáním BODIPY-FA v 0 min. Poté bylo jednou před druhým zobrazením dodáno 30 μl lipidových sond BODIPY, aby bylo možné pozorovat počáteční absorpci lipidů BODIPY v 1. min. Poté byly lipidy BODIPY dodány třikrát v intervalu 2 min před třetím zobrazovacím sezením ve 26. min a clearing BODIPY-FA přes laktační kanály byl analyzován ve 36. min a 46. min. Byl použit podomácku sestrojený konfokální mikroskop s laserovým skenováním videa34. Jako excitační zdroje pro fluorescenční zobrazování byly použity dva kontinuální lasery emitující vlnové délky 488 nm (MLD, Coherent) a 640 nm (Cube, Coherent). Pro detekci fluorescenčních signálů byly použity dva pásmové filtry (FF01-525/50 a FF01-685/40, Semrock). Axiální rozlišení pod 4 μm bylo získáno pomocí 100 μm dírky a 60x objektivu (LUMFLN, ponoření do vody, NA 1,1, Olympus). Snímky (512 × 512 pixelů) byly získány při snímkové frekvenci 30 Hz. Pro zlepšení poměru signálu k šumu obrazu byl šum na 90 snímcích po následném zpracování snímků v reálném čase (30 snímků/s) zprůměrován odstraněním pohybového artefaktu vzniklého peristaltikou pomocí vlastního programu MATLAB. Pro měření průměrné intenzity fluorescence v lamina propria byl použit software ImageJ (NIH).

Test absorpce lipidů

Po odstranění potravy po dobu 12 hodin bylo perorálním podáním podáno 200 μl olivového oleje (Sigma-Aldrich) pro měření triglyceridů v plazmě a barvení červenou barvou Oil Red O. Krev byla odebrána ocasní žílou do zkumavky na odběr krve obsahující heparin v 0, 1, 2, 3 a 4 h po podání olivového oleje. Koncentrace triglyceridů v plazmě byla měřena pomocí analyzátoru VetTest Chemistry (IDEXX Lab). Tenké střevo bylo obarveno olejovou červení O za 12 h po podání olivového oleje podle protokolu výrobce soupravy pro barvení olejovou červení O (MAK194, Sigma-Aldrich). Krmení dietou s vysokým obsahem tuku (HFD) (60 % kcal tuku, Research Diets, D12492) začalo ve věku 12 týdnů a pokračovalo po dobu 8 týdnů za účelem měření triglyceridů v plazmě a barvení Oil Red O. Krev byla odebrána ocasní žílou do zkumavky obsahující heparin po 6 hodinách lačnění. Pro barvení jaterních řezů metodou Oil red O byla odebrána játra, která byla přes noc fixována ve 4% PFA při 4 °C, nařezána na 100 μm řezy vibratomem (Leica, VT1200S) a obarvena metodou Oil red O.

Transdukce AAV

Indikované myši dostaly jednorázově i.p. dávku (1012 virových částic ve 150-200 µl) rekombinantního AAV kódujícího ligand vázající domény 1-4 VEGFR3 sloučené s doménou IgG Fc (AAV-mVEGFR31-4-Ig) a kontrolní myši dostaly stejnou dávku AAV kódujícího domény 4-7 VEGFR3, které neváží VEGF-C ani VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), sloučeného s doménou IgG Fc, jak bylo popsáno dříve37. AAV-mVEGFR31-4-Ig a AAV-mVEGFR34-7-Ig byly detekovány v séru imunoblotovou analýzou (protilátka proti VEGFR3; kozí polyklonální, AF743, R&D) o hodnotě 0.5 μl vzorků séra odebraných ve stejný den střevní analýzy.

Použití protilátky

Pro blokádu VEGFR2 jsme použili protilátku neutralizující VEGFR2 (DC101). Hybridomová buněčná linie, která produkuje DC101, byla zakoupena od American Type Culture Collection (ATCC). Hybridomové buňky byly pěstovány v bezsérovém médiu. Rekombinantní proteiny v supernatantech byly přečištěny sloupcovou chromatografií s agarosovým gelem Protein A (Oncogene). Po přečištění byly rekombinantní proteiny kvantifikovány pomocí Bradfordova testu a potvrzeny barvením Coomassieho modří po elektroforéze v dodecylsulfátu sodném (SDS) a polyakrylamidovém gelu (PAGE). DC101 (50 mg/kg) nebo stejné množství kontrolní protilátky (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) bylo i.p. aplikováno uvedeným myším každé 2 dny po dobu 2 týdnů.

Obohacení střevních LEC a izolace IntSC z tenkého střeva

Z tenkého střeva byla odstraněna seróza, svalová vrstva a mezenterická tuková tkáň. Po podélném otevření fragmentů střeva a promytí PBS byly vzorky rozřezány na kousky o délce 2 cm a byly odstraněny Peyerovy skvrny. Vzorky byly promyty PBS a inkubovány s 10 mM EDTA s DMEM bez vápníku a hořčíku (Gibco) na ledu po dobu 20 minut. Tkáně se vortexovaly s PBS bez vápníku, dokud se nezískal čirý supernatant, který byl zbaven epiteliálních buněk. Kousky vzorků byly dále rozřezány na 1 mm fragmenty a disociovány disociačním pufrem obsahujícím 2 mg/ml kolagenázy II (Worthington), 1 mg/ml dispázy (Gibco) a 1 U/ml DNázy (Invitrogen) v DMEM při 37 °C po dobu 30 min. Pro usnadnění disociace byly kousky tkání každých 10 min jemně pipetovány nahoru a dolů. Vzorky byly poté přefiltrovány přes 70 μm sítko, aby se mechanicky disagregovaly zbývající střevní fragmenty. Po shromáždění supernatantu byl přidán stejný objem DMEM obsahující 10 % fetálního hovězího séra (FBS). Po odstředění byly buňky resuspendovány v PBS. Pro obohacení frakce stromálních buněk a LEC byly hematopoetické buňky a epiteliální buňky depletovány pomocí AutoMACS (Miltenyi) po 15minutové inkubaci na ledu s mikročásticemi anti-CD45 a anti-CD326 (Miltenyi). Pro izolaci IntSC byly kromě anti-CD45 a anti-CD326 Microbeads přidány anti-CD31 Microbeads (Miltenyi) k depleci endoteliálních buněk.

Primární kultivace myších IntSC

Po izolaci IntSC byly buňky kultivovány s DMEM/F12 obsahujícím 10 % FBS na destičce pro tkáňové kultury po dobu 24 h nebo 2 dnů. Pro ošetření léčivy a imunofluorescenční barvení bylo na 4jamková komůrková sklíčka Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich) naneseno 50 000 buněk na jamku. Koncentrace léčiv jsou popsány v uvedených legendách obrázků a ošetření trvalo 6 h pro imunofluorescenční analýzu a analýzu genové exprese. Pro kultivaci IntSC na měkkých (1,5 kPa) a tuhých (28 kPa) matricích byla použita 35mm zobrazovací miska s pružně podepřeným povrchem (Ibidi) po dobu 24 h. Pro indukci cre aktivity v primárně kultivovaných IntSC získaných z WT nebo Yap/Tazi∆FRC myší byly buňky ošetřeny 5 µM 4-hydroxy-tamoxifenu (4-OHT) ve 100% etanolu (EtOH) nebo samotným 100% EtOH po dobu 2 dnů jako kontrola. Pro experimenty byla použita kultivačně rozšířená monovrstva IntSC, která byla validována jako PDGFRβ+.

Průtoková cytometrie a třídění buněk

Pro třídění PDGFRβ+ IntSC nebo střevních LEC se obohacené frakce podrobily RBC lýze suspenzí v ACK lyzačním pufru (Gibco) po dobu 5 min při RT. Po zablokování receptorů Fcγ myší anti-CD16/CD32 (553141, BD Bioscience) byly buňky inkubovány 15 min s uvedenými protilátkami v pufru FACS (2% FBS v PBS). Po několika promytích byly buňky analyzovány pomocí FACS Canto II (BD Biosciences) a získaná data byla dále vyhodnocena pomocí softwaru FlowJo (Treestar). Třídění buněk bylo provedeno pomocí FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Mrtvé buňky byly vyloučeny pomocí barvení DAPI (Sigma-Aldrich) a buněčné dublety byly systematicky vyloučeny. Intenzita fluorescence je vyjádřena v libovolných jednotkách na logaritmické stupnici a přímý rozptyl a boční rozptyl jsou znázorněny na lineární stupnici. Pro průtokovou cytometrii byly použity následující protilátky: FITC proti myšímu CD45 (11-0451-85, monoklonální potkan, Biolegend); FITC proti myšímu TER-119 (11-5921-85, monoklonální potkan, Biolegend); APC proti myšímu CD31 (551262, monoklonální potkan, BD Bioscience); a PE/Cy7 proti myšímu podoplaninu (127412, monoklonální syrský křeček, Biolegend).

Základní sekvenování RNA

Základní sekvenování RNA izolovaných PDGFRβ+ IntSC bylo provedeno získáním souboru pro zarovnání. Stručně řečeno, čtení byla mapována pomocí softwarového nástroje TopHat. Soubor zarovnání byl použit k sestavení transkriptů, odhadu jejich množství a detekci rozdílné exprese genů nebo izoforem pomocí manžet. Nástroj Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) byl použit k dalšímu vyhodnocení dat v kontextu kanonické signalizace a ke zjištění, zda jsou geny hyperaktivované YAP/TAZ specificky spojeny se sekrečními molekulami. Významnost kanonické signalizace byla testována postupem Benjamini-Hochberg, který upravuje hodnotu P pro korekci vícenásobných srovnání, a jejich aktivace nebo inhibice byla určena s ohledem na aktivační z-skóre. Shluková analýza a heatmapy byly vytvořeny pomocí programu Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Pro GSEA byly použity kolekce genových sad z databáze Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/).

MEF a HDLEC

Myší embryonální fibroblasty (MEF) byly izolovány z embryí E12,5, jak bylo popsáno dříve32. Stručně řečeno, tkáně hlavy, končetin a srdce byly odstraněny a vzorky byly rozřezány nůžkami a tráveny 0,1% trypsinem/EDTA s DNázou (1 U/ml, Invitrogen) při 37 °C po dobu 20 min. Po rozkladu a odstranění nestrávených tkání byly buňky krátce roztočeny, naneseny na misku o průměru 10 cm a ponechány růst do subkonfluence. MEF byly poté udržovány v DMEM/F12 obsahujícím 10 % FBS. Lidské kožní lymfatické endotelové buňky (HDLEC) byly zakoupeny od společnosti Lonza a kultivovány v endotelovém růstovém médiu (EGM2-MV, Lonza). MEF a HDLEC byly použity ve stadiu 2 nebo 3. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře s 5 % CO2 při 37 °C a bylo potvrzeno, že jsou mykoplazmaticky negativní (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Spheroid-based sprouting assay

LEC sféroidy byly vytvořeny kultivací HDLEC ve stadiu 2 nebo 3 v kultivačním médiu obsahujícím 0,25 % metylcelulózy a inkubací přes noc jako závěsné kapky36. Sféroidy byly poté odebrány a vloženy do 2 mg/ml kolagenu typu I (Corning), ošetřeny kontrolním bovinním sérovým albuminem (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) nebo ANGPT2 (5 μg/ml, vlastní výroba) s VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) nebo bez něj v médiu Endothelial Cell Basal Medium (PromoCell) obsahujícím 1 % FBS po dobu 24 hodin. Na konci inkubace byl sféroid obarven pomocí buněčného trackeru (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 min). Sféroidy byly poté fixovány ve 4% PFA po dobu 15 min při RT a zobrazeny pomocí Cell observer (Carl Zeiss).

Kvantitativní RT-PCR

RNA byla extrahována pomocí soupravy RNeasy Micro (Qiagen) nebo soupravy pro extrakci RNA Trizol (Invitrogen). Celkem 1 µg extrahované RNA bylo přepsáno do cDNA pomocí sady pro reverzní transkripci GoScript (Promega). Kvantitativní PCR v reálném čase byla provedena pomocí FastStart SYBR Green Master mix (Roche) a termocykléru S1000 (Bio-Rad) s uvedenými primery. Primery byly navrženy pomocí Primer-BLAST nebo převzaty z dříve publikovaných studií, které jsou popsány v doplňkové tabulce 1. Jako referenční gen byl použit Gapdh a výsledky byly prezentovány jako relativní exprese vůči kontrole. Specifičnost reakce primerů byla potvrzena analýzou křivky tání. Relativní exprese genů byla analyzována metodou ΔΔCt pomocí softwaru CFX Manager (Bio-Rad).

In vitro strečové a osmotické experimenty

MEF a primární myší IntSC byly natahovány pomocí mechanického přístroje pro natahování buněk (STREX) se 4% lineárním natahováním při 10 cyklech/min a osmotický stres byl aplikován pomocí 0,4 M sorbitolu po dobu 3 h, jak bylo popsáno dříve40,50. Buňky byly během všech experimentů uchovávány ve zvlhčeném inkubátoru s 5 % CO2 při teplotě 37 °C.

Ex vivo osmotické experimenty

Po otevření dutiny břišní v anestezii byla část jejuna tenkého střeva rozřezána na 2 cm kousky. Fragmenty střeva byly otevřeny podélně a promyty PBS. Tkáně byly poté kultivovány v DMEM/F12 včetně 5 % FBS a ihned byl aplikován osmotický stres pomocí 0,4 M sorbitolu v kultivačním médiu po dobu 3 h. Tkáně byly během všech experimentů uchovávány ve zvlhčeném inkubátoru s 5 % CO2 při 37 °C.

Imnofluorescenční barvení MEF

MEF byly naneseny na 8jamková komůrková sklíčka Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich) a fixovány 4 % paraformaldehydem po dobu 15 min při 4 °C. Po několika promytích PBS byly vzorky blokovány 5% kozím (nebo oslím) sérem v 0,5% PBST po dobu 30 min při RT. Buňky byly inkubovány s uvedenými primárními protilátkami při 4 °C přes noc. Navázané primární protilátky byly detekovány inkubací se sekundárními protilátkami po dobu 90 min při RT. Pro barvení buněk byly použity následující primární protilátky: anti-YAP (králičí monoklonální, 14074, Cell signaling); anti-TAZ (králičí polyklonální, HPA007415, Sigma-Aldrich); a protilátky proti falloidinu konjugované s Alexa Fluor 488 (A12379, Thermo Fisher). Sekundární protilátky konjugované s Alexa Fluor 594 byly zakoupeny od společnosti Jackson ImmunoResearch. Jádra byla obarvena DAPI (Invitrogen) a preparáty byly upevněny a zobrazeny podle výše uvedeného popisu.

ChIP-qPCR

MEF byly fixovány 1% PFA po dobu 10 min a zhášeny glycinem. Vzorky byly promyty PBS a lyzovány lyzačním pufrem obsahujícím 1 % SDS. Fixovaná DNA v buněčných lyzátech byla sonikována pomocí přístroje Focused-ultrasonicator (Covaris). Buněčné lyzáty byly odstředěny a všechny supernatanty kromě 5 % (uložených pro vstupní kontrolu celobuněčného lyzátu) byly zředěny ředicím pufrem ChIP obsahujícím 0,5 % Tritonu X-100. Naředěné vzorky byly poté inkubovány přes noc při 4 °C s protilátkou anti-TEAD4 (myší monoklonální, ab58310, Abcam). Poté byly přidány protein A/G Dynabeads (Thermo Fisher) a vzorky byly inkubovány 2 h při 4 °C. Kuličky byly izolovány pomocí DynaMag-2 (Thermo Fisher), promyty sérií promývacích pufrů ChIP: promývací pufr s nízkým obsahem soli, promývací pufr s vysokým obsahem soli, promývací pufr LiCl a TE pufr. Vzorky byly eluovány v 1% SDS dvakrát po dobu 15 min při 65 °C. Kuličky byly odstraněny a eluovaný materiál i vstupní vzorky z 5% celobuněčného lyzátu byly přes noc reverzně zesítěny při 65 °C. Po normalizaci pH byly vzorky inkubovány 30 min s RNázou (3 μg/ml) při 37 °C a 2 h s proteinázou K (20 mg/ml) a glykogenem (20 mg/ml) při 55 °C. DNA byla eluována standardními postupy a ChIP-DNA byla analyzována pomocí qPCR v porovnání se vstupními vzorky s použitím primerů uvedených v doplňkové tabulce 2.

ELISA

Supernatant primárně kultivovaných myších IntSC byl po natažení odebrán a supernatant byl centrifugován po dobu 15 min. Koncentrace VEGF-C v supernatantu byla měřena pomocí enzymatické imunosorbční analýzy (ELISA) se soupravou ELISA specifickou pro myší VEGF-C (CSB-E07361m, Cusabio).

Morfometrická analýza

Morfometrická měření byla provedena pomocí softwaru ImageJ (NIH), softwaru ZEN 2012 (Carl Zeiss) nebo Imaris (Bitplane). Pro kvantifikaci plochy mléčné žlázy byl pro analyzované snímky nastaven práh a pro každou mléčnou žlázu v rámci žlázy byla změřena absolutní plocha LYVE-1+. Absolutní délka mléčné žlázy, absolutní délka klků a absolutní šířka klků byly měřeny pomocí snímků imunobarvení klků E-cadherinem+ nebo CD31+ nebo LYVE-1+ v každém náhodném poli o velikosti 850 µm2 v uvedené části střeva. Pro kvantifikaci plochy povrchu mléčné žlázy a klků, délky a šířky bylo analyzováno nejméně 100 klků podél celého tenkého střeva. Kvantifikace následujících parametrů v tenkém střevě byla provedena v jejunu. Počet výhonků mléčné žlázy a počet větvení mléčné žlázy byly měřeny u 10-20 náhodně vybraných LYVE-1+ mléčných žláz. Počet Prox1+ LEC a počet Prox1+EdU+ LEC byl spočítán ručně v rámci 100 μm délky 10-20 náhodných LYVE-1+ laktátů. Kvantifikace VE-kadherin+ spojů mléčné žlázy byla provedena objektivem ×40 v mléčných žlázách 5-10 klků na myš. Stručně řečeno, spoje zipového typu byly definovány jako souvislé spoje na hranicích buněk s buňkami, které mají protáhlý tvar51. Button-like junction byl definován jako diskontinuální junkce, které nejsou paralelní s hranicemi buněk a tvar buněk připomínající dubový list. Spoje, které neodpovídají ani jednomu ze vzorů, byly klasifikovány jako smíšený typ. Intenzita fluorescence (FI) BODIPY a její kvantifikace byla provedena podle předchozího popisu34. Plocha olejové červeně O byla měřena jako plocha olejové červeně O+ vydělená plochou vlásečnic a normalizována průměrem ploch kontrolních myší. Plocha pokrytí hladkých svalových buněk villan byla měřena jako absolutní plocha pokrytí αSMA+ v pěti polích o rozloze 850 µm2 na vzorek, která byla poté normalizována průměrem polí kontrolních myší. Pro kvantifikaci relativní exprese laktačního VEGFR3 byl průměr FI měřen v pěti 425 µm2 polích na vzorky a byl prezentován jako relativní hodnoty vydělené jeho kontrolními hodnotami. Pro stanovení hustoty krevních cév byla plocha VEGFR2 měřena v pěti polích o velikosti 425 µm2 na vzorek a prezentována jako relativní hodnoty vztažené k jeho kontrole. Plocha CD3+ T buněk nebo F4/80+ makrofágů byla měřena v pěti 425 µm2 polích na vzorky. Hustota lymfatických cév byla vypočtena měřením plochy LYVE-1+ v pěti náhodných polích o rozloze 425-850 µm2 z celkových vzorků a prezentována jako relativní hodnoty k její kontrole.

Sekvenování RNA z jednotlivých buněk na základě kapek

Tříděné jednotlivé buňky byly zpracovány pomocí sady 10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) podle protokolů výrobce. Stručně řečeno, vytříděné buňky byly resuspendovány v PBS s 0,5 % BSA a smíchány se směsí RT činidel a RT primerem, které byly poté přidány do každého kanálu v 10X čipech, přičemž cílem bylo 5000 buněk. Buňky byly separovány do gelových kuliček v emulzi, kde byly transkripty RNA z jednotlivých buněk označeny čárovým kódem a reverzně přepsány. Po konstrukci knihovny cDNA a amplifikaci byly molekuly cDNA enzymaticky fragmentovány, na konci opraveny a opatřeny A-ocasem. Po výběru vhodné velikosti zpracovaných molekul cDNA pomocí dvojitého výběru velikosti pomocí kuliček SPRI (Beckman Coulter) byly tyto molekuly ligovány adaptérem a byla provedena PCR s indexem vzorku. Po další dvojnásobné selekci velikosti pomocí kuliček SPRI byly konečné knihovní konstrukty desetkrát naředěny a spuštěny na vysoce citlivém čipu Agilent Bioanalyzer pro kontrolu kvality. Jednobuněčné knihovny byly poté sekvenovány pomocí platformy Illumina HiSeq-X.

Předběžné zpracování dat jednobuněčné RNA

Data surového sekvenování byla nejprve de-multiplexována a mapována na myší referenční genom (mm10) pomocí sady nástrojů Cell Ranger 3.0.2 od společnosti 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Pomocí balíčku R Seurat (verze 3.0.0)52 byly sestaveny surové expresní matice pomocí funkce Read10X. Buňky s méně než 1000 detekovanými geny nebo s více než 6000 detekovanými geny (považovanými za potenciální dublety) byly vyloučeny (doplňkový obr. 17a). Kromě toho byly buňky s vysokým počtem jedinečných molekulárních identifikátorů (UMI) spojených s mitochondriálními geny (>7 % z celkového počtu) považovány za mrtvé buňky, a proto byly vyloučeny. U genů byly odstraněny ty, které byly exprimovány méně než 3 buňkami. Kromě toho byl po počátečním kole shlukování vyloučen malý počet kontaminujících Ptprc+ imunitních buněk a Pecam1+ Cdh5+ endoteliálních buněk. Po odstranění nežádoucích buněk a genů byly počty UMI pro každý gen pro danou buňku vyděleny celkovou expresí dané buňky a vynásobeny 10 000 a logaritmicky transformovány. Poté byly geny škálovány a centrovány regresí mimo proměnné, jako je procento mitochondriálních genů a počet UMI.

Identifikace proměnných genů a redukce dimenzionality

Pro shlukovou analýzu byl použit balíček R Seurat. Nejprve byly identifikovány vysoce variabilní geny napříč souborem dat pomocí funkce FindVariableFeatures v nástroji Seurat s možností: selection.method = „vst“. Pro následnou analýzu bylo vybráno 2000 nejlepších genů s nejvyšší variabilitou. Na základě identifikovaných variabilních genů byla provedena počáteční redukce dimenzionality pomocí analýzy hlavních komponent (PCA). Ke stanovení statistické významnosti skóre PCA byla použita funkce JackStraw. Nejvýznamnějších 30 hlavních komponent (PC) bylo použito jako vstup pro Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) k redukci dat do dvourozměrného prostoru.

Klastrová analýza

Za účelem shlukování buněk podle jejich transkripčních profilů jsme provedli neřízené shlukování na 2000 nejvariabilnějších genech pro všechny čtyři vzorky. Nejprve jsme sestavili graf sdílených nejbližších sousedů (SNN) v prostoru hlavních komponent pomocí funkce FindNeighbors. Poté jsme použili louvainův algoritmus pro shlukování založené na optimalizaci modularity pomocí funkce FindClusters. Parametry rozlišení shluků byly nastaveny v bodě, kde shluky vykazovaly vysoce odlišné transkripční profily. Shlukování bylo nezávislé na počtu detekovaných genů na buňku (doplňkový obr. 17b). Markery specifické pro shluk byly diferenciálně exprimované geny pro každý shluk identifikované pomocí funkce FindMarkers v programu Seurat s následujícími nastaveními: min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15,test.use = „MAST“. Identifikované markery s upraveným P < 0,05 byly použity pro další analýzu. Vzhledem k tomu, že některé typy buněk, jako jsou buňky hladkého svalstva a muralní buňky, měly dobře známé markery, jejich výskyt na vrcholu seznamu markerů pro každý klastr potvrdil naše postupy výběru markerů. Pro odstranění nežádoucího zdroje variací, jako je pohlaví, byly buňky rozděleny podle přítomnosti ženského specifického transkriptu Xist a integrovány. Abychom mohli provést integraci různých datových sad, nejprve jsme logaritmicky normalizovali každou surovou expresní matici a identifikovali jsme 2000 vysoce variabilních genů pro každou datovou sadu. Poté jsme pomocí funkce FindIntegrationAnchors v programu Seurat identifikovali kotvy mezi datovými sadami. Poté byly datové sady integrovány na základě identifikovaných kotev pomocí funkce IntegrateData v nástroji Seurat. Integrované datové sady byly poté škálovány a rozměry byly redukovány pro další shlukovou analýzu. Shluky v integrovaných souborech dat byly anotovány podle expresních profilů genů v identifikovaných seznamech tvůrců.

Analýza obohacení genové ontologie

Analýza obohacení genové ontologie na markerech shluků byla provedena pomocí balíčku R goseq (verze 1.34.0)53 . V závislosti na délce genu byly pro každý gen získány váhy a k identifikaci souvisejících termínů genové ontologie byla použita Walleniova aproximace. Byly vybrány termíny genové ontologie, které mají upravené P < 0,05, a kategorie biologických procesů.

Statistika

K předurčení velikosti vzorku nebyly použity žádné statistické metody. Experimenty byly randomizovány a vyšetřovatelé byli během experimentů a analýz výsledků zaslepeni ohledně alokace. Všechny hodnoty jsou prezentovány jako průměr ± směrodatná odchylka (SD). Statistická významnost byla stanovena pomocí oboustranného Mannova-Whitneyho U testu mezi dvěma skupinami nebo dvoucestné ANOVY s Holm-Sidakovým testem mnohonásobného porovnání pro porovnání více skupin. Statistické analýzy byly provedeny pomocí programu GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.