1 Teorie
Oligonukleotidy se syntetizují přidáním jedné báze po druhé, která se táhne od 3′ k 5′ konci, připojené k nosiči na pevné fázi. Po dokončení chemické syntézy oligonukleotidu se řetězec DNA uvolní z pevného nosiče inkubací s hydroxidem amonným. Amonium působí také jako deprotektivní činidlo, které odštěpuje skupiny chránící fosfáty ve fosfodiesterových vazbách. Poté se přidá horký amoniak, který hydrolyzuje ochranné skupiny z exocyklických aminoskupin deoxyadenosinu, deoxycytosinu a deoxyguanosinu. Oligonukleotid by mohl být dodán uživateli v roztoku amoniaku jako surový přípravek. V takovém případě může být před použitím nutné provést další krok k odstranění solí a vedlejších produktů z oligonukleotidového přípravku vzniklých během deprotekce.
Po deprotekci se oligonukleotidový přípravek obvykle odsolí, kvantifikuje, odpaří do sucha v lyofilizátoru a dodá uživateli ve formě prášku. Odsolený roztok oligonukleotidu obsahuje oligonukleotid plné délky, ale také směs zkrácených produktů, které se nahromadily během chemické syntézy. Ke zkrácení dochází, když se určitá báze nepřidá do řetězce v příslušném cyklu (Hecker & Rill, 1998). Procento zkrácených produktů nahromaděných v přípravku je tedy určeno účinností syntézy (podíl plnodélkového produktu po syntéze) a délkou molekuly. Dlouhé oligonukleotidy, jejichž syntéza vyžaduje více cyklů, jsou méně čisté než krátké oligonukleotidy. Tyto poruchy mohou v některých aplikacích konkurovat produktu plné délky a může být nutné je odstranit před použitím oligonukleotidu. Odsolené oligonukleotidové preparáty jsou však obvykle vhodné pro mnoho aplikací, jako je standardní PCR nebo microarrays, zejména pokud je délka oligonukleotidu < 20 nukleotidů.
Další čištění u oligonukleotidů delších než 50 bází se doporučuje, protože procento produktu plné délky v preparátu obvykle není vyšší než 80 %. Pro náročné aplikace, kde je důležitá přesná délka oligonukleotidu, jako jsou testy gelového posunu, mutageneze řízená místem, sekvenování, výroba klonovacích adaptérů nebo syntéza prvního řetězce cDNA pro tvorbu knihoven, se doporučuje další purifikace, a to i pro kratší oligonukleotidy (více informací o technikách viz výše na stránce Standardní testy in vitro pro interakce proteinů a nukleových kyselin – testy gelového posunu pro vazbu RNA a DNA a mutageneze řízená místem).
Purifikace může být vyžadována po syntéze nebo po enzymatické modifikaci oligonukleotidu. Existuje několik metod, jak toho dosáhnout, a volba závisí na povaze oligonukleotidu a aplikaci, pro kterou je určen.
Purifikace HPLC v reverzní fázi je založena na hydrofobicitě. Používá nepolární stacionární fázi a vodné pufry a organická rozpouštědla jako mobilní fázi k eluci analytů; polární sloučeniny jsou eluovány jako první, zatímco nepolární sloučeniny jsou zadržovány. Tato metoda je nejlepší pro purifikaci oligonukleotidů modifikovaných hydrofobní skupinou, jako je biotin, fluorescenční barviva nebo NHS-esterové konjugace. Hmotnostní výtěžnost je vyšší než při použití purifikace PAGE a je vhodná pro purifikaci větších množství oligonukleotidů (v mmolickém měřítku), i když neodstraňuje neúplné produkty tak účinně. Patrony pro purifikaci oligonukleotidů založené na chromatografii s reverzní fází poskytují rychlou metodu odsolování a purifikace oligonukleotidů.
Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) rozlišuje oligonukleotidy podle jejich délky, a nabízí tak dostatečné rozlišení pro odlišení produktů plné délky od neúspěšných molekul (Atkinson a Smith, 1984). Polyakrylamidové gely jsou pro oddělení malých fragmentů DNA účinnější než agarózové gely (viz Analýza RNA pomocí analytické polyakrylamidové gelové elektroforézy a agarózové gelové elektroforézy). Jedinou nevýhodou polyakrylamidových gelů je, že se obtížněji připravují a manipuluje se s nimi než s agarózovými gely. Polyakrylamidové gely probíhají ve vertikálním uspořádání v konstantním elektrickém poli. Po elektroforéze se oligonukleotid z gelu eluuje a koncentruje pomocí srážení ethanolem (více o srážení nukleových kyselin najdete na stránce Purifikace RNA – metody srážení) nebo chromatografie na reverzní fázi. Tuto metodu je vhodné zvolit, pokud je pro náročné aplikace požadováno co nejvyšší procento oligonukleotidů plné délky. Důrazně se doporučuje také pro oligonukleotidy delší než 30 bází. Rovněž lze provádět několik vzorků současně a není zapotřebí žádné drahé vybavení. Jedinou nevýhodou této techniky je malé množství oligonukleotidu získaného na jedno přečištění. Obvykle se používají oligonukleotidy v měřítku 1 μmol nebo méně a výtěžnost hmotnosti po purifikaci PAGE je < 50 % a v případě modifikovaných oligonukleotidů ještě nižší. Nicméně i když je výtěžnost nízká, je pro většinu biochemických aplikací uspokojivá.
Přípravek oligonukleotidu se naloží na denaturační polyakrylamidový gel v množství nejméně 1 mg na pruh. Rozsah rozlišení gelu závisí na koncentraci polyakrylamidu. Pro krátké oligonukleotidy (od 15 do 35 bází) se doporučuje 13-15% polyakrylamidový gel; pro delší oligonukleotidy (od 35 do 70 bází) se doporučuje 8-13% polyakrylamidový gel. Procento gelu by mělo být přizpůsobeno běžícímu systému. Obvykle používáme systém Bio-Rad Mini Protean II a k purifikaci oligonukleotidů o délce 25 bází používáme 15% gely. Po identifikaci správného pásu pomocí UV vizualizace se pás vyřízne a extrahuje z gelu.
V této kapitole jsou popsány dvě různé metody purifikace oligonukleotidů z polyakrylamidových gelů. Nejjednodušší metodou je eluce pomocí difúze. Ta je založena na pohybu molekul z oblasti s vyšší koncentrací do oblasti s nižší koncentrací. Výsledkem difúze je postupné promíchávání materiálu. Tato metoda je časově náročná, ale nevyžaduje příliš mnoho práce ani žádné vybavení. V podstatě se polyakrylamidový pás obsahující zájmový oligonukleotid nakrájí na malé kousky a pokryje se elučním pufrem. Po inkubaci se DNA ze supernatantu přečistí srážením etanolem. Výtěžnost je omezená a pohybuje se mezi 20 a 70 % v závislosti na délce oligonukleotidu. Čím větší množství elučního pufru se použije, tím více oligonukleotidu se z gelu rozptýlí.
Druhou metodou je elektroeluce do dialyzačního sáčku (McDonell et al., 1977). Kousek gelu obsahující oligonukleotid se vyřízne a vloží do dialyzačního vaku s pufrem. Působením elektrického proudu dochází k migraci DNA z gelu do pufru dialyzačního vaku. Oligonukleotid se z tohoto pufru získá a přečistí. Touto metodou lze oligonukleotid izolovat s dobrým výtěžkem, i když je časově náročná, pokud se purifikuje velký počet vzorků najednou, protože vyžaduje vložení každého gelového pásu do jednotlivých dialyzačních sáčků. Tato metoda také dobře funguje pro větší fragmenty DNA a lze ji použít i k extrakci DNA z agarózových gelů.