DNA polymeráza je důležitý biologický enzym, který je přítomen při replikaci DNA. Při ní dochází ke kopírování DNA na dvě dceřiné molekuly DNA a k syntéze nového vlákna DNA ze stávajícího vlákna přidáváním dNTP do rostoucí DNA.
Polymeráza DNA má při replikaci dvě klíčové úlohy: Polymerázová aktivita 5′ až 3′ exonukleázy a korektorová aktivita 3′ až 5′ exonukleázy. Když se polymeráza naváže na DNA, přidává nukleotid ve směru 5′ až 3′.
Naneštěstí, protože se deaktivuje při vyšší teplotě, není DNA polymeráza vhodná pro typ replikace nazývaný polymerázová řetězová reakce (PCR). Naproti tomu Taq DNA Polymeráza hraje při PCR zásadní roli.
Co je Taq polymeráza?
Taq DNA polymeráza je vysoce termostabilní rekombinantní DNA polymeráza. Je pojmenována podle Thermus aquaticus, bakterie odolné vůči teplu, ze které se izoluje. Molekulová hmotnost Taq polymerázy je 94 kD a amplifikuje DNA do 5 kb s rychlostí elongace 0,9-1,2 kb/min při teplotě 70-75 °C.
Co je polymerázová řetězová reakce (PCR)?
Polymerázová řetězová reakce neboli PCR je replikační technika, která vytváří četné kopie určité oblasti DNA in vitro (ve zkumavce, nikoli v organismu). PCR se využívá v různých oblastech biologie a medicíny, včetně molekulárně biologického výzkumu, lékařské diagnostiky a ekologie.
PCR je založena na Taq polymeráze, termostabilní DNA polymeráze. Vyžaduje také primery DNA, které jsou navrženy speciálně pro zájmovou oblast DNA, a také templátovou DNA a nukleotidy (stavební bloky DNA).
Při reakci PCR sestavíte klíčové složky ve zkumavce spolu s kofaktory, které enzym vyžaduje. Složky procházejí opakovanými cykly zahřívání a ochlazování, které nakonec syntetizují DNA.
K tomu, abyste dosáhli PCR, musíte také provést tři základní kroky, mezi něž patří např:
- Denaturace (96 °C): Reakci silně zahřejte, aby došlo k oddělení neboli denaturaci vláken DNA.
- Žíhání (55-65 °C): Ochlazení reakce, aby se primery mohly navázat na své komplementární sekvence na jednořetězcové templátové DNA.
- Extenze (72 °C): Zvyšte teplotu reakce, aby Taq polymeráza prodloužila primery a syntetizovala nová vlákna DNA.
Cyklus se opakuje 25-35krát v typické reakci PCR, která obvykle trvá 2-4 hodiny v závislosti na délce kopírované oblasti DNA. Pokud je reakce účinná, může se cílová oblast změnit z jedné nebo několika málo kopií na miliardy.
Úloha Taq polymerázy v PCR
Díky své klíčové roli při syntéze a amplifikaci nových vláken DNA je Taq DNA polymeráza pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) nezbytná.
Stejně jako ostatní polymerázy DNA může Taq polymeráza vytvářet DNA, pouze pokud má k dispozici primer, krátkou sekvenci 20 nukleotidů, které poskytují výchozí bod pro syntézu DNA. Je to však také termostabilní DNA polymeráza, která může pracovat při vyšších teplotách.
Taq DNA polymeráza je vysoce účinná, takže se stává plně funkční, jakmile dosáhne své optimální teploty. Má také poločas rozpadu delší než dvě hodiny (při teplotě 92 °C), vysokou kapacitu amplifikace a schopnost přidat 150 nukleotidů za sekundu.
Vyberte si společnost G-Biosciences pro své základy PCR
Ve společnosti G-Biosciences nabízíme řadu sad a produktů pro vaše aplikace PCR a Taq DNA polymerázy. Chcete-li si objednat, navštivte naše webové stránky ještě dnes.