Zatížení multirezistentní infekcí Acinetobacter baumannii u hospitalizovaných pacientů v nepálské nemocnici terciární péče

Úvod

Acinetobacter baumannii je aerobní, nefermentativní, gramnegativní, nepohyblivý, kokobacil, který v sobě ukrývá řadu účinných faktorů virulence.1 Tento organismus je schopen přežívat v širokém spektru podmínek prostředí a dlouhodobě přetrvává na površích, což z něj činí častou příčinu propuknutí infekce a infekce spojené se zdravotní péčí.2 Hlavní problém způsobený A. baumannii v nemocničním prostředí se týká především kriticky nemocných pacientů na jednotkách intenzivní péče (JIP), zejména těch, kteří vyžadují mechanickou ventilaci, a pacientů s poraněním nebo popáleninami. Infekce spojené s A. baumannii zahrnují pneumonie spojené s ventilátorem, infekce kůže a měkkých tkání, infekce ran, infekce močových cest, sekundární meningitidu a infekce krevního řečiště.3

Acinetobacter baumannii se celosvětově stal významným MDR nozokomiálním patogenem a v posledním desetiletí je hlášen stále častěji, pravděpodobně v důsledku rostoucího používání širokospektrých antibiotik u hospitalizovaných pacientů.4 Americká společnost pro infekční nemoci (ISDA) uvedla A. baumannii jako jeden z patogenů „červené výstrahy“, které značně ohrožují užitečnost našeho současného antibakteriálního armamentaria.5 Četné studie naznačují vzestupný trend prevalence MDR A. baumannii, ale míra rezistence se může značně lišit podle jednotlivých nemocnic, měst nebo zemí. Vzhledem k tomu, že infekce vyvolané MDR Acinetobacterem se obvykle vyskytují u těžce nemocných pacientů, je s nimi spojená hrubá mortalita vysoká a pohybuje se od 26 % do 68 %.6

Multirezistentní A. baumannii si vyvinul rezistenci k většině dostupných antibiotik včetně karbapenemů, které jsou léky volby při léčbě těžkých infekcí.7 Hlavní mechanismus β-laktamové rezistence u A. baumannii odpovídá efluxním pumpám, mutacím porinů a produkci získaných β-laktamových hydrolyzujících enzymů, tj. β-laktamáz třídy A (β-laktamázy s rozšířeným spektrem, ESBL), třídy B (metalo-β-laktamázy, MBL), ampicilinázy třídy C (AmpC) a také β-laktamáz třídy D. Tyto enzymy se u A. baumannii vyskytují ve všech případech. Rezistence ke karbapenemům způsobená produkcí MBL a dalších karbapenemáz má potenciál rychlého šíření v nemocničním prostředí, protože je často plazmidově zprostředkovaná a včasná detekce lékové rezistence je nezbytná pro správný výběr antibiotik k léčbě infekcí vyvolaných A. baumannii u hospitalizovaných pacientů a k zahájení účinných opatření pro kontrolu infekcí, aby se zabránilo jejich šíření v nemocničním prostředí.8,9

S ohledem na výše uvedené názory byla provedena studie na A. baumannii izolovaných od hospitalizovaných pacientů za účelem stanovení jejich citlivosti na antibiotika, identifikace MDR kmenů a detekce různých β-laktamáz mezi MDR izoláty.

Materiál a metody

Laboratorní studie byla provedena na oddělení klinické mikrobiologie Tribhuvan University Teaching Hospital (TUTH), nepálského centra terciární péče, od ledna 2017 do prosince 2017 (po dobu 12 měsíců). Všechny klinické vzorky odebrané od hospitalizovaných pacientů s podezřením na infekci představující různé tělesné lokality (sputum, bronchoalveolární laváž, endotracheální aspirát, vzorky hnisu a stěrů, různé tělesné tekutiny, moč, krev, špičky katétrů atd.) byly zpracovány podle standardních mikrobiologických metod doporučených Americkou společností pro mikrobiologii (ASM) pro izolaci a identifikaci A. baumannii.10

Testování citlivosti na antibiotika (AST)

Citlivost izolátů A. baumannii vůči různým antibiotikům byla stanovena modifikovanou Kirby-Bauerovou diskovou difuzní metodou na Mueller-Hintonově agaru a interpretována podle standardních postupů doporučených Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), Wayne, USA.11 Profil citlivosti všech izolátů A. baumannii na antibiotika byl stanoven testováním proti ampicilin-sulbaktamu (10/10 μg), ceftazidimu (30 μg), gentamicinu (10 μg), ciprofloxacinu (5 μg), levofloxacinu (5 μg), meropenemu (10 μg) a imipenemu (10 μg). Izoláty, které byly rezistentní alespoň k jedné antimikrobiální látce ze tří různých skupin výše uvedených antibiotik (tj. izoláty MDR), byly testovány také proti piperacilinu (100 μg), piperacilin-tazobaktamu (100/10 μg), cefotaxim (30 μg), cefepim (30 μg), kotrimoxazol (25 μg), amikacin (30 μg), doxycyklin (30 μg), polymyxin B (300 jednotek) a kolistin sulfát (10 μg) od společnosti HiMedia Laboratories, Indie.

Identifikace MDR izolátů

Multirezistentní izoláty A. baumannii byly identifikovány podle pokynů doporučených Evropským centrem pro prevenci a kontrolu nemocí (ECDC). Izoláty necitlivé na alespoň jednu antimikrobiální látku ze tří nebo více antimikrobiálních tříd byly identifikovány jako MDR.12

Detekce producentů β- laktamázy s rozšířeným spektrem (ESBL)

Počáteční screeningový test na produkci ESBL byl proveden testováním s disky s ceftazidimem (CAZ, 30 μg) a cefotaximem (CTX, 30 μg). Izoláty byly považovány za potenciální producenty ESBL, pokud inhibiční zóna (ZOI) byla <18 mm pro CAZ nebo <23 mm pro CTX. Izoláty, které byly na základě screeningového testu podezřelé jako producenti ESBL, byly dále testovány kombinovanou diskovou metodou (CD) pro potvrzení produkce ESBL, při které byly použity CAZ a CTX samostatně a v kombinaci s kyselinou klavulanovou. Po inkubaci po dobu 16-18 hodin při teplotě 35 ± 2 °C bylo u obou antimikrobiálních látek v kombinaci s kyselinou klavulanovou potvrzeno zvýšení ZOI o ≥ 5 mm oproti jejich inhibiční zóně při testování samostatně jako pozitivní producenti ESBL.11

Detekce producentů AmpC β-laktamáz

Acinetobacter baumannii produkující zónu inhibice <18 mm pro disk s cefoxitinem (CX, 30 μg) byl testován na produkci AmpC β-laktamáz. AmpC β-laktamáza byla zjištěna testem s AmpC diskem. Při této metodě byl indikátorový kmen Escherichia coli citlivý na cefoxitin (ATCC 25922) naočkován na standardní MHA desku, aby se vytvořila trávníková kultura, a byl umístěn disk s cefoxitinem. Slepý disk o průměru 6 mm navlhčený pufrem Tris-EDTA byl naočkován několika koloniemi testovaného kmene a umístěn vedle disku s cefoxitinem. Destičky byly inkubovány při 37 °C přes noc. Po celonoční inkubaci byl vrub v inhibiční zóně cefoxitinu přiléhající k disku obsahujícímu testovaný kmen považován za pozitivní na produkci AmpC β-laktamázy.13

Detekce producentů metalo β-laktamázy (MBL) a karbapenemázy Klebsiella pneumoniae (KPC)

Izoláty byly podrobeny detekci produkce MBL a KPC při rezistenci k meropenemu (MEM, 10 μg). Pro detekci a rozlišení MBL, KPC nebo koproducentů KPC/MBL byla použita kombinovaná disková metoda s meropenemem, jak popsal Tsakris et al.14 Při tomto testu byly použity čtyři disky; (a) MEM = obyčejný MEM disk (10 μg), b) MEM+EDTA = MEM disk (10 μg) s 292 μg EDTA, c) MEM+kyselina fenylboronová (PBA) = MEM disk (10 μg) obsahující 400 μg PBA a d) MEM+EDTA+PBA = MEM disk (10 μg) s 292 μg EDTA i 400 μg PBA. EDTA působí jako inhibitor MBL, zatímco PBA je inhibitor KPC. Test byl proveden naočkováním Mueller-Hintonova agaru testovaným organismem, jak je uvedeno u standardní difuzní metody, a byly použity čtyři disky. Po inkubaci přes noc při 37 °C byl průměr ZOI kolem disků MEM+EDTA, MEM+PBA a MEM+EDTA+PBA porovnán s průměrem kolem obyčejného disku MEM. Za produkci MBL se považovalo, když se průměr ZOI kolem disků MEM+EDTA a MEM+EDTA+PBA zvýšil o ≥ 5 mm oproti průměru ZOI kolem samotného disku MEM. Za produkci KPC se považovalo, když se průměr ZOI kolem disků MEM+PBA a MEM +EDTA +PBA zvýšil o ≥ 5 mm oproti průměru ZOI kolem samotného disku MEM. O koprodukci enzymů KPC i MBL se uvažovalo, když se průměr ZOI kolem disků MEM+EDTA+PBA zvýšil o ≥ 5 mm oproti průměru ZOI kolem samotného disku MEM. Je třeba poznamenat, že koncentrace PBA a EDTA použité v této studii nevykazovaly žádný zjistitelný vliv na růst bakterií.

Zpracování a analýza dat

Data týkající se demografických údajů pacientů, vzorků, oddělení, antibakteriálních profilů, determinantů rezistence byla analyzována pomocí programu SPSS verze 16.0 a interpretována podle rozdělení četností a procent.

Výsledky

V průběhu sledovaného období bylo izolováno celkem 177 A. baumannii. Z celkového počtu izolátů A. baumannii byla většina z nich (N=161, 91,0 %) identifikována jako MDR.

Rozdělení MDR Acinetobacter baumannii

Z celkového počtu 161 izolátů MDR byla většina (47.2 %) bylo izolováno ze vzorků z dýchacích cest (tj. sputa, bronchoalveolární laváže a tracheálního aspirátu), dále z hnisu a stěrů, tělních tekutin, moči, krve a nejméně jich bylo ze špiček katétrů (1,2 %) (tabulka 1). Z celkového počtu izolátů MDR bylo 58,3 % izolováno od mužů a 41,7 % od žen, přičemž poměr mužů k ženám byl 1,4. The highest number of isolates were from male patients with age group ≥65 years (14.9%) and the least number was isolated from a female patient with age group 49–64 years (5.0%) (Table 2). Similarly, the higher number of MDR isolates were isolated from ICU patients (49.6%) followed by surgical wards (19.9%) and medical wards (14.3%), while the lowest number from burn wards (1.9%) (Table 3).

Table 1 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii in Various Clinical Specimens

Table 2 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii by Gender and Age Group of Patients

Tabulka 3 Rozdělení MDR Acinetobacter baumannii podle oddělení

Antibiogram MDR Acinetobacter baumannii

Profil citlivosti k antibiotikům ukazuje, že většina izolátů MDR byla rezistentní k většině prvo-linie antibiotik. Mezi nimi byly všechny izoláty zcela rezistentní k piperacilinu a cefotaximu. Podobně 99,4 % bylo rezistentních k ceftazidimu a cefepimu, 98,7 % ke kotrimoxazolu, 95 % k piperacilin-tazobaktamu a ciprofloxacinu, 93,8 % ke gentamicinu, 89,4 % k ampicilin-sulbaktamu a meropenemu. Pouze 11,8 %, 12,4 %, 13,6 % a 37,9 % bylo citlivých na levofloxacin, imipenem, amikacin a doxycyklin. Všechny izoláty MDR byly zcela citlivé pouze na antibiotika poslední instance, tj. polymyxin B a kolistin sulfát (obrázek 1).

Figure 1 Percentage of antimicrobial resistance and sensitivity of MDR A. baumannii (N = 161).

ESBL, AmpC, MBL, and KPC Production in MDR Acinetobacter baumannii

In this study, the rate of β-lactamases production among MDR isolates was significantly high. MBL was the common β-lactamase detected among MDR A. baumannii (67.7%). ESBL was detected in 19.9%, AmpC in 38.5%, and KPC in 9.3% of MDR isolates. The co-production of different types of β-lactamases was also seen among some isolates. ESBL+AmpC co-producers were seen in 6.8%, ESBL+MBL co-producers in 5.0%, AmpC+MBL co-producers in 23.0% and MBL+KPC in 5.6% of MDR isolates (Table 4).

Table 4 β-Produkce laktamáz u MDR Acinetobacter baumannii

Diskuse

Acinetobacter baumannii je významný nozokomiální patogen spojený s celou řadou onemocnění u hospitalizovaných pacientů, zejména na jednotkách intenzivní péče, který představuje větší výzvu pro management a kontrolu infekcí u pacientů. Celosvětový výskyt MDR izolátů A. baumannii vyvolává velké obavy.15

V naší studii byl MDR A. baumannii často izolován ze vzorků z dýchacích cest (47,2 %), dále z hnisu a stěrů (27,3 %), tělních tekutin (11,1 %) a dalších. Studie provedená Shresthou et al v roce 201515 ze stejné nemocnice rovněž zaznamenala 49,18 % MDR A. baumannii ze vzorků z dýchacích cest a Samawi et al16 z Kataru uvedli 48,9 % A. baumannii z infekce dýchacích cest. Demografické údaje v naší studii ukázaly, že vysoká prevalence infekcí byla u pacientů mužského pohlaví, kteří měli věk ≥ 65 let, a většina izolátů MDR pocházela od pacientů z JIP, protože tato bakterie má zálibu ve vyšších věkových skupinách a těžce nemocných pacientech na JIP.

Počet MDR A. baumannii v naší studii je 91,0 %, což je extrémně vysoká hodnota. Také ve studii provedené Shresthou et al a Mishrou et al bylo přibližně 96 %, resp. 95 % A. baumannii MDR.17,18 Tento vysoký výskyt MDR A. baumannii může být způsoben vysokou pravděpodobností šíření genu rezistence a jejich schopností vyskytovat se všude v nemocničním prostředí. Infekce A. baumannii s vysokým počtem MDR izolátů nás také alarmuje, že je třeba dále rozsáhle studovat a aplikovat preventivní opatření ke snížení této obávané hrozby u hospitalizovaných pacientů. V této studii byly zjištěny multirezistentní izoláty A. baumannii významně rezistentní ke karbapenemům, aminoglykosidům a skupině fluorochinolonových antibiotik. Téměř všechny MDR izoláty byly rezistentní k piperacilinu a cefalosporinům, 93,8 % bylo rezistentních ke gentamycinu a 89,4 % k meropenemu, což je více, než uvádí Mishra et al18 ze stejné nemocnice (téměř 89 % a 50 % izolátů bylo rezistentních k cefalosporinům a karbapenemům). Studie provedená Xia et al v Číně prokázala rezistenci ke karbapenemům u 85 % izolátů, což je téměř podobné jako v této studii.19 Program MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) z roku 2007 prokázal, že v Evropě bylo 74,1 % izolátů citlivých k meropenemu a 78,9 % citlivých k imipenemu, ve srovnání s mnohem nižší citlivostí 51,3 % a 52,0 % v několika asijských zemích.20,21 Náš výsledek týkající se míry rezistence k amikacinu byl 86 %.3 %, což je více než 54 % v předchozí studii ze stejné nemocnice.18 Velmi znepokojivý je také rostoucí výskyt vysoce rezistentních kmenů vůči aminoglykosidům. V této studii bylo 95,0 % a 88,2 % A. baumannii MDR rezistentních k ciprofloxacinu, resp. levofloxacinu. Rezistence na fluorochinolony v posledních letech u klinických izolátů rychle narůstá kvůli jejich širokému používání v klinické medicíně jako širokospektrých antimikrobiálních látek. V naší studii vykazovaly polymyxin B a kolistin sulfát vynikající účinek proti MDR A. baumannii, protože žádný z izolátů nebyl shledán rezistentním vůči kolistin sulfátu a polymyxinu B. Ale ve studii Josepha et al22 a Al-Sweih et al23 bylo 20 %, resp. 12 % Acinetobacter spp. rezistentních vůči kolistin sulfátu. Tato studie však ukázala vysokou míru rezistence vůči běžně používaným antibiotikům a je nevýhodou pro systém zdravotní péče v zemích, jako je Nepál, protože může výrazně ovlivnit léčbu pacientů. Důvodem může být intenzivní používání antimikrobiálních látek v nemocnicích, snadná dostupnost a nevybíravé používání těchto léků mimo nemocnice a mnoho antibiotik je k dispozici volně prodejných pro samoléčbu. Rozvoj rezistence k antibiotikům je spojen s vysokou morbiditou a mortalitou hospitalizovaných pacientů, zejména na jednotkách intenzivní péče.

Snížená citlivost A. baumannii vůči cefalosporinům třetí a čtvrté generace by mohla být způsobena producenty ESBL nebo AmpC β-laktamázy nebo některými jinými relevantními základními mechanismy. Tato studie ukázala, že 19,9 % A. baumannii s MDR bylo producenty ESBL. Podobná míra ESBL byla zjištěna v předchozí studii Parajuli et al u pacientů na jednotkách intenzivní péče.24 Ve studii Mishra et al18 bylo pouze 12,9 % Acinetobacter spp. producenty ESBL. V indické studii25 bylo pouze 7 % izolátů A. baumannii producenty ESBL, zatímco jiná studie z Indie8 dokumentovala 29,9 % Acinetobacter spp. jako producenty ESBL. Studie prokázaly, že prevalence ESBL se v jednotlivých zemích a institucích liší jak u nozokomiálních, tak u komunitních izolátů. To lze přičíst zvyklostem při předepisování antibiotik a přítomnosti patogenů, které mají geny pro produkci ESBL. Přestože neexistují žádné pokyny CLSI pro detekci produkce β-laktamáz AmpC, postupovali jsme podle diskového testu AmpC.13 V této studii byla zjištěna prevalence A. baumannii produkujících AmpC 35,6 %. Téměř podobnou prevalenci AmpC produkujících Acinetobacter spp. ze stejné nemocnice zaznamenali Parajuli et al.24 V indické studii však byla dokumentována vyšší míra (56 %) AmpC produkujících A. baumannii.26

Carbapenem-rezistentní Acinetobacter baumannii (CRAB) je zařazen do priority 1 (tj. kritické) globálního seznamu prioritních bakterií rezistentních vůči antibiotikům, kterým se řídí výzkum, objevování a vývoj nových léčiv Světovou zdravotnickou organizací.27 Ačkoli existují různé mechanismy vzniku rezistence ke karbapenemům, nejúčinnějším mechanismem je produkce enzymu karbapenemázy.9 Výskyt MBL u A. baumannii se stává terapeutickou výzvou, protože tyto enzymy mají vysokou hydrolytickou aktivitu, která vede k degradaci cefalosporinů a karbapenemů vyšší generace. Geny MBL zprostředkované plazmidy se navíc rychle šíří na další druhy gramnegativních bacilů.28 Rychlá detekce produkce MBL je proto nezbytná pro modifikaci terapie a zahájení účinné kontroly infekce, aby se zabránilo jejich šíření. V současné studii byly izoláty produkující metaloß-laktamázu (MBL) zjištěny častěji než producenti ESBL a AmpC, přičemž 67,7 % A. baumannii s MDR bylo producenty MBL. V Nepálu bylo provedeno jen několik studií o prevalenci MBL, Shrestha et al29 uvedli 47,2 % a Parajuli et al24 uvedli 78,8 % producentů MBL u Acinetobacter spp. ze stejné nemocnice. Ve studii Deye a Bairy30 byly MBL zaznamenány pouze u 21,7 % Acinetobacter spp. koexistence více genů MBL u bakterií je alarmující. Vzhledem k tomu, že MBL geny jsou spojeny s integrony, které mohou být vloženy do transpozonů, které zase mohou být umístěny na plazmidech, čímž vzniká vysoce mobilní genetický aparát, je pravděpodobné další šíření těchto genů u různých patogenů. Tato studie se také pokusila zjistit izoláty produkující KPC, kde 9,5 % A. baumannii produkovalo MDR a některé z nich také spoluprodukovaly enzym MBL. Ačkoli neexistuje jediný článek týkající se detekce KPC z Nepálu, Parajuli et al24 nedávno uvedli druh Acinetobacter produkující KPC od pacientů na jednotkách intenzivní péče. Většina izolátů produkujících KPC byla hlášena z USA, Řecka, Číny, Izraele a Kolumbie.31 Mezi karbapenemázami má KPC vysokou frekvenci a byla běžně nalezena u Klebsiella pneumonia.32 Mezi izoláty produkujícími β-laktamázy byly některé izoláty také koproducenty různých β-laktamáz a MDR izoláty produkující dva různé typy β-laktamáz vykazovaly vysoký profil rezistence. Šíření bakterií produkujících karbapenemázy po celém světě je v posledních letech považováno za velkou hrozbu pro veřejné zdraví. Poté, co se objevily klony rezistentní ke karbapenemům, zbývá naděje na léčbu MDR infekce A. baumannii pomocí poslední možnosti potenciálně toxických antibiotik, jako jsou polymyxin B a kolistin sulfát.33

Studie ukazuje, že infekce MDR A. baumannii se v naší nemocnici zvyšuje alarmujícím tempem. Nyní se stalo velmi důležitým tuto situaci zvládnout dříve, než nabude smrtelně nebezpečných rozměrů. Proto je nutné rychle zjistit determinanty rezistence, aby bylo možné upravit terapii a zahájit účinnou kontrolu infekcí a zabránit jejich šíření.

Omezení

Vzhledem k tomu, že jsme neměli k dispozici dostatek údajů od pacientů, nemohli jsme vyhodnotit rizikové faktory a výsledky infekcí vyvolaných MDR A. baumannii u hospitalizovaných pacientů. Dále nebyla stanovena genetická analýza rezistentních fenotypů a mechanismů lékové rezistence.

Závěr

Z této studie vyplývá, že infekce u hospitalizovaných pacientů způsobené MDR A. baumannii jsou časté. Míra produkce MBL, ESBL a AmpC mezi izoláty MDR vysoce vzrostla a tyto bakterie mohou vést k vysoké morbiditě a mortalitě, protože nám zbývá jediná možnost léčby potenciálně toxickými antibiotiky, jako je kolistin sulfát a polymyxin B, a to je pro hospitalizované pacienty nepříjemný problém. Zavedená doporučení zahrnující řádné zjišťování rezistence patogenů vůči lékům, politiku omezování antimikrobiálních látek, aby se zabránilo nadměrnému používání širokospektrých antibiotik, zlepšení systémů sledování rezistence a důsledná opatření pro kontrolu infekcí pomohou tuto situaci zvládnout.