Antes de la disponibilidad de ordenadores, la determinación de los valores de KM y Vmax requería la manipulación algebraica de la ecuación básica de Michaelis-Menten. Debido a que Vmax se aproxima asintóticamente (véase la Figura 8.11), es imposible obtener un valor definitivo a partir de un gráfico típico de Michaelis-Menten. Dado que KM es la concentración de sustrato en Vmax/2, también es imposible determinar un valor preciso de KM. Sin embargo, la Vmax puede determinarse con precisión si la ecuación de Michaelis-Menten se transforma en una que dé un gráfico de línea recta. Tomando el recíproco de ambos lados de la ecuación 23 se obtiene
Un gráfico de 1/V0 frente a 1/, llamado gráfico de Lineweaver-Burk o de doble recíproco, produce una línea recta con una intercepción de 1/Vmax y una pendiente de KM/Vmax (Figura 8.36). La intercepción en el eje x es -1/KM.
Figura 8.36
Un gráfico de doble reciprocidad o Lineweaver-Burk. Un gráfico de doble reciprocidad de la cinética enzimática se genera trazando 1/V0 como una función 1/. La pendiente es la KM/Vmax, el intercepto en el eje vertical es 1/Vmax, y el intercepto en el eje horizontal (más…)
Los gráficos de doble reciprocidad son especialmente útiles para distinguir entre inhibidores competitivos y no competitivos. En la inhibición competitiva, la intercepción en el eje y de la gráfica de 1/V0 frente a 1/ es la misma en presencia y en ausencia de inhibidor, aunque la pendiente aumenta (Figura 8.37). El hecho de que el intercepto no cambie se debe a que un inhibidor competitivo no altera la Vmax. A una concentración suficientemente alta, prácticamente todos los sitios activos están ocupados por el sustrato y la enzima es totalmente operativa. El aumento de la pendiente del gráfico 1/V0 frente a 1/ indica la fuerza de unión del inhibidor competitivo. En presencia de un inhibidor competitivo, la ecuación 31 se sustituye por
en la que es la concentración del inhibidor y Ki es la constante de disociación del complejo enzima-inhibidor.
Figura 8.37
Inhibición competitiva ilustrada en un gráfico de doble reciprocidad. Un gráfico de doble reciprocidad de la cinética de la enzima en presencia (
)y ausencia (
) de un inhibidor competitivo ilustra que el inhibidor no tiene ningún efecto sobre la Vmáx pero aumenta la KM.
En otras palabras, la pendiente de la gráfica se incrementa en el factor (1 + /Ki) en presencia de un inhibidor competitivo. Considere una enzima con una KM de 10-4 M. En ausencia de inhibidor, V0 = Vmax/2 cuando = 10-4 M. En presencia de un inhibidor competitivo de 2 × 10-3 M que se une a la enzima con una Ki de 10-3 M, la KM aparente (KappM ) será igual a KM × (1 + /Ki), o 3 × 10-4 M. La sustitución de estos valores en la ecuación 23 da como resultado V0 = Vmax/4, cuando = 10-4 M. La presencia del inhibidor competitivo reduce así la velocidad de reacción a la mitad a esta concentración de sustrato.
En la inhibición no competitiva (figura 8.38), el inhibidor puede combinarse con la enzima o con el complejo enzima-sustrato. En la inhibición no competitiva pura, los valores de las constantes de disociación del inhibidor y de la enzima y del complejo enzima-sustrato son iguales (sección 8.5.1). El valor de Vmax disminuye hasta un nuevo valor llamado Vappmax, por lo que el intercepto en el eje vertical aumenta. La nueva pendiente, que es igual a KM/Vappmax, es mayor por el mismo factor. A diferencia de la Vmax, la KM no se ve afectada por la inhibición no competitiva pura. La velocidad máxima en presencia de un inhibidor no competitivo puro, Vimax, viene dada por
Figura 8.38
Inhibición no competitiva ilustrada en un gráfico de doble reciprocidad. Un gráfico de doble reciprocidad de la cinética de la enzima en presencia (
) y en ausencia (
) de un inhibidor no competitivo muestra que el KM no se altera y la Vmax disminuye.