Distintos subconjuntos de fibroblastos regulan la integridad láctea a través del VEGF-C inducido por YAP/TAZ en las vellosidades intestinales

Animales de experimentación

Todo el cuidado de los animales y los procedimientos experimentales cumplieron con todas las regulaciones éticas para la investigación y las pruebas con animales bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (No. KA2016-12) del Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST). Los ratones Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 y Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 fueron transferidos, establecidos y criados en instalaciones de animales libres de patógenos específicos (SPF) en el KAIST. Los ratones C57BL/6 J, R26-tdTomato y Myh11-Cre-ERT2 se adquirieron en el Jackson Laboratory. Todos los ratones fueron mantenidos en el fondo C57BL/6 y alimentados con libre acceso a una dieta estándar (PMI LabDiet) y agua. Para inducir la actividad de Cre en los ratones Cre-ERT2, se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) 2 mg de tamoxifeno (Sigma-Aldrich) disueltos en aceite de maíz (Sigma-Aldrich) en los puntos temporales indicados para cada experimento. Los ratones Cre-ERT2 negativos pero flox/flox-positivos entre los compañeros de camada se definieron como ratones de control (WT) para cada experimento. Los ratones fueron anestesiados con una inyección i.p. de una combinación de anestésicos (80 mg/kg de ketamina y 12 mg/kg de xilacina) antes de ser sacrificados.

Análisis histológicos

Para la tinción de todo el intestino delgado, se realizó una perfusión transcardial con paraformaldehído (PFA) al 2% después de la anestesia. Se cosechó el intestino delgado y se cortó longitudinalmente para exponer el lumen. Tras varios lavados con PBS, los intestinos se fijaron en placas de silicona. Las muestras se posfijaron a 4 °C en PFA al 4% durante 2 h. Las muestras se lavaron con PBS varias veces y posteriormente se deshidrataron con sacarosa al 10% en PBS durante 2 h y con sacarosa al 20%, glicerol al 10% en PBS durante toda la noche. La piel de la oreja, la tráquea y el diafragma se recogieron sin perfusión transcardial y se fijaron en PFA al 4% durante 1 hora a 4 °C. Las muestras se lavaron con PBS varias veces antes de bloquearlas. Tras el bloqueo con suero de cabra o de burro al 5% en Triton-X 100 al 0,5% en PBS (PBST) durante 1 h, las muestras se incubaron con los anticuerpos primarios indicados diluidos en la solución de bloqueo a 4 °C durante toda la noche. Tras varios lavados con PBST, las muestras se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente (RT) con los anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo indicados y diluidos en el tampón de bloqueo. Las muestras se lavaron con PBST y los núcleos se tiñeron con DAPI (Invitrogen). Tras el lavado con PBS, las muestras se montaron con Vecta-shield (Vector Laboratories). Las imágenes se obtuvieron utilizando el microscopio confocal Zeiss LSM 800 o LSM 880 (Carl Zeiss).

En la inmunotinción se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios y secundarios: anti-LYVE-1 (policlonal de conejo, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (monoclonal de rata, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (monoclonal de hámster, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-cadherina (policlonal de cabra, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (policlonal de cabra, AF2727, R&D, 1:400); anti-Prox1 (policlonal de conejo, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anti-VE-cadherina (policlonal de cabra, AF1002, R&D, 1:200); anti-PDGFRβ (monoclonal de rata, ab91066, Abcam, 1:200); antiPAI-1 (monoclonal de ratón, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (policlonal de cabra, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (monoclonal de conejo, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (policlonal de conejo, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (policlonal de conejo, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (policlonal de conejo, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (policlonal de cabra, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (policlonal de conejo, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (policlonal de cabra, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (monoclonal de conejo, 14074, Cell signaling, 1:200); anti-TAZ (policlonal de conejo, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-αSMA, conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (monoclonal de ratón, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (policlonal de cabra, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (policlonal de cabra, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (monoclonal de conejo, 13179, Cell signaling, 1:400); anti-F4/80, conjugado con FITC (monoclonal de rata, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (monoclonal de hámster, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmina (policlonal de conejo, AB907, Millipore, 1:400); y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 y Alexa Fluor 647 contra el conejo, la rata, la cabra y el hámster (diluidos en una proporción de 1:1000) se adquirieron en Jackson ImmunoResearch. Todos los anticuerpos utilizados en nuestro estudio fueron validados para las especies y aplicaciones.

Hibridación in situ por fluorescencia de una sola molécula (smFISH)

Para la smFISH del intestino delgado, se realizó una perfusión transcardial con PFA al 2% después de la anestesia. Las muestras se posfijaron a 4 °C en PFA al 4% durante 2 h. Las muestras se lavaron con PBS varias veces, se pasaron a sacarosa al 30% y se incubaron durante la noche. Se seccionaron las muestras incrustadas en OCT y se realizó el smFISH según el protocolo del fabricante que se describe en el kit RNAscope Fluorescent Multiplex Assay (320850, ACDBio). Para el smFISH se utilizó la sonda RNA scope (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2). En la inmunotinción con smFISH se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios y secundarios: anti-PDGFRβ (monoclonal de rata, ab91066, Abcam); anti-Shisa3 (policlonal de conejo, TA320118, Origene); anti-P2X1 (policlonal de conejo, APR-001, Alomone labs) y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647 fueron adquiridos de Jackson ImmunoResearch. Las imágenes se obtuvieron utilizando el microscopio confocal Zeiss LSM 800 o LSM 880 (Carl Zeiss).

Ensayo de incorporación de EdU para la proliferación de LECs

Para detectar la proliferación de LECs en el lácteo, se disolvieron 5 mg de 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU, A10044, Invitrogen) en 1 ml de agua Milli-Q como solución madre. A continuación, se inyectaron 200 μl de la solución madre por ratón i.p. en días alternos durante una semana antes del análisis. Se aisló el intestino delgado y se procesó como se ha descrito anteriormente. Las células incorporadas con EdU se detectaron con el kit de ensayo Click-iT EdU Alexa Fluor-488 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Microscopía electrónica

Para capturar imágenes de la ultraestructura del intestino delgado al microscopio electrónico, se seccionó después de la perfusión transcardial con PFA al 4% y glutaraldehído al 0,25% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). A continuación, las muestras se fijaron durante la noche en glutaraldehído al 2,5%, se posfijaron con tetróxido de osmio al 1% y se deshidrataron con una serie de concentraciones crecientes de etanol, tras lo cual se incrustaron en resina. Se obtuvieron secciones lácteas ultrafinas de 70 nm utilizando un ultramicrotomo (UltraCut-UCT, Leica), que luego se recogieron en rejillas de cobre. Las muestras se visualizaron con EM de transmisión (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) a 120 kV después de la tinción con acetato de uranilo al 2% y citrato de plomo.

Imagen intravital de la eliminación de lípidos de la lámina propia

Los ratones fueron anestesiados tras la eliminación de los alimentos durante 12 h antes del procedimiento. La obtención de imágenes intravitales se llevó a cabo como hemos descrito previamente34. Brevemente, las sondas lipídicas BODIPY (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) se disolvieron en una solución de DMSO al 2,5% (Sigma-Aldrich). El anticuerpo anti-LYVE-1 (monoclonal de rata, 223322, R&D) conjugado con Alexa Fluor 647 (Invitrogen) (0,75 mg/kg) se inyectó por vía intravenosa 12 h antes de la obtención de imágenes para el etiquetado fluorescente de los lacteales. A continuación, se exteriorizó el yeyuno proximal en una cámara de imagen donde se mantuvo la temperatura a 37 °C durante la obtención de imágenes. Tras la apertura quirúrgica de la luz intestinal 1,5 cm a lo largo del borde antimesentérico, se colocó un cubreobjetos en la luz expuesta para obtener una vista de las vellosidades. Las imágenes intravitales se realizaron en tres sesiones. Primero se tomaron imágenes de las vellosidades antes del suministro de BODIPY-FA a los 0 minutos. A continuación, se suministraron 30 μl de sondas de lípidos de BODIPY una vez antes de la segunda sesión de obtención de imágenes para observar la absorción inicial de lípidos de BODIPY a 1 min. A continuación, se suministraron los lípidos de BODIPY tres veces con intervalos de 2 min antes de la tercera sesión de imágenes a los 26 min, y se analizó el aclaramiento de BODIPY-FA a través de los canales lácteos a los 36 min y 46 min. Se utilizó un microscopio confocal de escaneo láser casero34. Se utilizaron dos láseres de onda continua que emitían a 488 nm (MLD, Coherent) y 640 nm (Cube, Coherent) como fuentes de excitación para las imágenes de fluorescencia. Se utilizaron dos filtros de paso de banda (FF01-525/50 y FF01-685/40, Semrock) para la detección de las señales fluorescentes. La resolución axial por debajo de 4 μm se adquirió con un agujero de alfiler de 100 μm y una lente objetivo de 60x (LUMFLN, inmersión en agua, NA 1,1, Olympus). Se obtuvieron imágenes (512 × 512 píxeles) a una frecuencia de cuadro de 30 Hz. Para la mejora de la relación señal/ruido de la imagen, se promedió el ruido a lo largo de 90 fotogramas tras el posprocesamiento de las imágenes en tiempo real (30 fotogramas/seg.) eliminando el artefacto de movimiento generado por el peristaltismo con un programa MATLAB escrito a medida. Se utilizó el software ImageJ (NIH) para medir la intensidad fluorescente media en la lámina propia.

Test de absorción de lípidos

Después de la eliminación de los alimentos durante 12 h, se administraron 200 μl de aceite de oliva (Sigma-Aldrich) por sonda oral para la medición de los triglicéridos en plasma y la tinción con Oil Red O. Se tomaron muestras de sangre a través de la vena de la cola en el tubo de recogida de sangre que contenía heparina a las 0, 1, 2, 3 y 4 h después de la administración de aceite de oliva. La concentración de triglicéridos en plasma se midió con un analizador VetTest Chemistry (IDEXX Lab). El intestino delgado se tiñó con Oil red O a las 12 h de la ingestión de aceite de oliva siguiendo el protocolo del fabricante del kit de tinción con Oil Red O (MAK194, Sigma-Aldrich). La alimentación con una dieta alta en grasas (60% kcal de grasa, Research Diets, D12492) comenzó a las 12 semanas de edad y continuó durante 8 semanas para la medición de los triglicéridos en plasma y la tinción con Oil Red O. Se tomaron muestras de sangre a través de la vena de la cola en un tubo de recogida de sangre con heparina después de 6 horas de ayuno. Para la tinción con Oil red O de las secciones de hígado, se cosechó el hígado, se fijó en PFA al 4% durante la noche a 4 °C, se cortaron en secciones de vibratome de 100 μm (Leica, VT1200S), se tiñeron con Oil red O.

Transducción de AAV

Los ratones indicados recibieron una única dosis i.p. (1012 partículas virales en 150-200 µl) de un AAV recombinante que codifica los dominios de unión al ligando 1-4 de VEGFR3 fusionados al dominio Fc de IgG (AAV-mVEGFR31-4-Ig), y los ratones de control recibieron la misma dosis de AAV que codifica los dominios 4-7 de VEGFR3, que no se unen a VEGF-C o VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), fusionados al dominio Fc de IgG, como se ha descrito previamente37. Los AAV-mVEGFR31-4-Ig y AAV-mVEGFR34-7-Ig se detectaron en el suero mediante análisis de inmunotransferencia (anticuerpo anti-VEGFR3; policlonal de cabra, AF743, R&D) de 0.5 μl de muestras de suero recogidas el mismo día del análisis intestinal.

Tratamiento del anticuerpo

Para el bloqueo de VEGFR2, utilizamos un anticuerpo neutralizante de VEGFR2 (DC101). Se adquirió una línea celular de hibridoma que produce DC101 de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células de hibridoma se cultivaron en medio libre de suero. Las proteínas recombinantes en los sobrenadantes se purificaron mediante cromatografía en columna con gel de agarosa Protein A (Oncogene). Tras la purificación, las proteínas recombinantes se cuantificaron mediante el ensayo de Bradford y se confirmaron mediante la tinción con azul de Coomassie tras la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) y poliacrilamida (PAGE). DC101 (50 mg/kg) o una cantidad igual del anticuerpo de control (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) se inyectó i.p. en los ratones indicados cada 2 días durante 2 semanas.

Enriquecimiento de LEC intestinales y aislamiento de IntSC del intestino delgado

Se extrajo la serosa, la capa muscular y los tejidos adiposos mesentéricos del intestino delgado. Tras abrir los fragmentos de intestino longitudinalmente y lavarlos con PBS, las muestras se cortaron en trozos de 2 cm y se retiraron las placas de Peyer. Las muestras se lavaron con PBS y se incubaron con 10 mM de EDTA con DMEM libre de calcio y magnesio (Gibco) en hielo durante 20 minutos. Los tejidos se agitaron en vórtex con PBS libre de calcio hasta obtener un sobrenadante claro y desprovisto de células epiteliales. Los trozos de muestra se cortaron en fragmentos de 1 mm y se disociaron con tampón de disociación que contenía 2 mg/ml de colagenasa II (Worthington), 1 mg/ml de Dispasa (Gibco) y 1 U/ml de DNasa (Invitrogen) en DMEM a 37 °C durante 30 minutos. Para ayudar a la disociación, los trozos de tejido se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo cada 10 min. A continuación, las muestras se filtraron a través de un colador de 70 μm para disgregar mecánicamente los fragmentos intestinales restantes. Tras recoger los sobrenadantes, se añadió un volumen igual de DMEM con un 10% de suero bovino fetal (FBS). Tras la centrifugación, las células se resuspendieron en PBS. Para enriquecer la fracción de células estromales y LECs, las células hematopoyéticas y las células epiteliales se agotaron utilizando AutoMACS (Miltenyi) después de la incubación durante 15 minutos en hielo con microperlas anti-CD45 y anti-CD326 (Miltenyi). Para el aislamiento de IntSC, se añadieron microperlas anti-CD31 (Miltenyi) para eliminar las células endoteliales además de las microperlas anti-CD45 y anti-CD326.

Cultivo primario de IntSCs de ratón

Después del aislamiento de IntSCs, las células se cultivaron con DMEM/F12 conteniendo 10% de FBS en una placa de cultivo tisular durante 24 h o 2 días. Para los tratamientos farmacológicos y la tinción de inmunofluorescencia, se colocaron 50.000 células por pocillo en portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek II de 4 pocillos (Sigma-Aldrich). Las concentraciones de fármacos se describen en las leyendas de las figuras indicadas y los tratamientos duraron 6 h para el análisis de inmunofluorescencia y expresión génica. Se utilizó una placa de imagen de 35 mm con superficie de soporte elástico (Ibidi) para el cultivo de IntSC en matrices blandas (1,5 kPa) y rígidas (28 kPa) durante 24 h. Para la inducción de la actividad de cre en cultivos primarios de IntSC derivados de ratones WT o Yap/Tazi∆FRC, las células se trataron con 5 µM de 4-hidroxi-tamoxifeno (4-OHT) en etanol (EtOH) al 100% o EtOH al 100% solo durante 2 días como control. Para los experimentos se utilizaron monocapas de IntSCs expandidas en cultivo que fueron validadas como PDGFRβ+.

Citometría de flujo y clasificación celular

Para clasificar las IntSCs PDGFRβ+ o las LECs intestinales, las fracciones enriquecidas pasaron a lisis RBC por suspensión en tampón de lisis ACK (Gibco) durante 5 min a RT. Tras bloquear los receptores Fcγ con anti-CD16/CD32 de ratón (553141, BD Bioscience), las células se incubaron durante 15 min con los anticuerpos indicados en tampón FACS (2% FBS en PBS). Tras varios lavados, las células se analizaron con el FACS Canto II (BD Biosciences) y los datos adquiridos se evaluaron posteriormente mediante el software FlowJo (Treestar). La clasificación de las células se realizó con el FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Se excluyeron las células muertas mediante la tinción con DAPI (Sigma-Aldrich) y se excluyeron sistemáticamente los dobletes de células. La intensidad de la fluorescencia se expresa en unidades arbitrarias en una escala logarítmica, y la dispersión frontal y la dispersión lateral se representan en una escala lineal. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la citometría de flujo: FITC anti-ratón CD45 (11-0451-85, monoclonal de rata, Biolegend); FITC anti-ratón TER-119 (11-5921-85, monoclonal de rata, Biolegend); APC anti-ratón CD31 (551262, monoclonal de rata, BD Bioscience); y PE/Cy7 anti-podoplanina de ratón (127412, monoclonal de hámster sirio, Biolegend).

Secuenciación de ARN a granel

La secuenciación de ARN a granel de las IntSCs PDGFRβ+ aisladas se realizó obteniendo el archivo de alineación. Brevemente, las lecturas se mapearon utilizando la herramienta de software TopHat. El archivo de alineación se utilizó para ensamblar los transcritos, estimar sus abundancias y detectar la expresión diferencial de los genes o isoformas utilizando cufflinks. Se utilizó la herramienta Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) para evaluar aún más los datos en el contexto de la señalización canónica y determinar si los genes hiperactivados por YAP/TAZ estaban específicamente relacionados con las moléculas secretoras. La significación de la señalización canónica se comprobó mediante el procedimiento Benjamini-Hochberg, que ajusta el valor P para corregir las comparaciones múltiples, y su activación o inhibición se determinó con referencia a las puntuaciones z de activación. El análisis de clústeres y los mapas de calor se generaron utilizando Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Para el GSEA, se utilizaron colecciones de conjuntos de genes de la Base de Datos de Firmas Moleculares 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/).

MEFs y HDLECs

Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) se aislaron de embriones E12.5 como se ha descrito previamente32. Brevemente, se extrajeron los tejidos de la cabeza, las extremidades y el corazón y las muestras se picaron con tijeras y se digirieron con tripsina/EDTA al 0,1% con DNasa (1 U/ml, Invitrogen) a 37 °C durante 20 min. Tras la digestión y la eliminación de los tejidos no digeridos, las células se centrifugaron brevemente, se colocaron en una placa de 10 cm y se dejaron crecer hasta la subconfluencia. Las MEF se mantuvieron en DMEM/F12 con un 10% de FBS. Las células endoteliales linfáticas dérmicas humanas (HDLEC) se compraron a Lonza y se cultivaron en medio de crecimiento endotelial (EGM2-MV, Lonza). Las MEF y las HDLEC se utilizaron en el paso 2 o 3. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada del 5% de CO2 a 37 °C y se confirmó que eran negativas al micoplasma (kit de detección MycoAlert, Lonza).

Ensayo de brotación basado en esferoides

Los esferoides de las HDLEC se generaron cultivando las HDLEC en el pasaje 2 o 3 en medio de cultivo que contenía un 0,25% de metilcelulosa y se incubaron durante la noche como gotas colgantes36. A continuación, se recogieron los esferoides y se incrustaron en 2 mg/ml de colágeno tipo I (Corning), tratados con albúmina de suero bovino (BSA, Sigma-Aldrich) de control, WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) o ANGPT2 (5 μg/ml, generado por la propia empresa) con o sin VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) en medio basal para células endoteliales (PromoCell) con un 1% de FBS durante 24 h. Al final de la incubación, el esferoide se tiñó con rastreador celular (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 min). A continuación, los esferoides se fijaron en PFA al 4% durante 15 min a RT y se obtuvieron imágenes utilizando Cell observer (Carl Zeiss).

RT-PCR cuantitativa

El ARN se extrajo utilizando el kit RNeasy Micro (Qiagen) o el kit de extracción de ARN Trizol (Invitrogen). Un total de 1 µg de ARN extraído se transcribió a ADNc utilizando el kit de transcripción inversa GoScript (Promega). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando la mezcla maestra FastStart SYBR Green (Roche) y el termociclador S1000 (Bio-Rad) con los cebadores indicados. Los cebadores se diseñaron utilizando Primer-BLAST o se adoptaron de estudios previamente publicados, que se describen en la Tabla Suplementaria 1. Se utilizó Gapdh como gen de referencia y los resultados se presentaron como expresiones relativas al control. La especificidad de la reacción de los cebadores se confirmó mediante el análisis de la curva de fusión. La expresión génica relativa se analizó mediante el método ΔΔCt utilizando el software CFX Manager (Bio-Rad).

Experimentos de estiramiento y osmóticos in vitro

Las MEFs y las IntSCs primarias de ratón se estiraron utilizando un instrumento de estiramiento celular mecánico (STREX) con un 4% de estiramiento lineal a 10 ciclos/min, y se aplicó estrés osmótico con sorbitol 0,4 M durante 3 h como se ha descrito previamente40,50. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada al 5% de CO2 a 37 °C durante todos los experimentos.

Experimentos osmóticos ex vivo

Después de abrir la cavidad abdominal bajo anestesia, se cortó la parte del yeyuno del intestino delgado en trozos de 2 cm. Los fragmentos de intestino se abrieron longitudinalmente y se lavaron con PBS. A continuación, los tejidos se cultivaron en DMEM/F12 incluyendo un 5% de FBS y se aplicó inmediatamente un estrés osmótico con 0,4 M de sorbitol en el medio de cultivo durante 3 h. Los tejidos se mantuvieron en una incubadora humidificada con un 5% de CO2 a 37 °C durante todos los experimentos.

Tinción de inmunofluorescencia de los MEFs

Los MEFs se chaparon en portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek II de 8 pocillos (Sigma-Aldrich) y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min a 4 °C. Tras varios lavados con PBS, las muestras se bloquearon con suero de cabra (o de burro) al 5% en PBST al 0,5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios indicados a 4 °C durante la noche. Los anticuerpos primarios unidos se detectaron incubando con anticuerpos secundarios durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios para la tinción celular: anticuerpos anti-YAP (monoclonal de conejo, 14074, Cell signaling); anti-TAZ (policlonal de conejo, HPA007415, Sigma-Aldrich); y anticuerpos anti-faloidina conjugados con Alexa Fluor 488 (A12379, Thermo Fisher). Los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 594 se adquirieron en Jackson ImmunoResearch. Los núcleos se tiñeron con DAPI (Invitrogen) y los portaobjetos se montaron y se obtuvieron imágenes como se ha descrito anteriormente.

ChIP-qPCR

Los FME se fijaron con PFA al 1% durante 10 minutos y se apagaron con glicina. Las muestras se lavaron con PBS y se lisaron con tampón de lisis que contenía 1% de SDS. El ADN fijado en los lisados celulares se sonicó utilizando un ultrasonido focalizado (Covaris). Los lisados celulares se centrifugaron y todo menos el 5% (guardado para el control de entrada del lisado de células enteras) de los sobrenadantes resultantes se diluyó con tampón de dilución ChIP que contenía 0,5% de Tritón X-100. Las muestras diluidas se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-TEAD4 (monoclonal de ratón, ab58310, Abcam). A continuación, se añadieron Dynabeads de proteína A/G (Thermo Fisher) y las muestras se incubaron durante 2 h a 4 °C. Las perlas se aislaron con DynaMag-2 (Thermo Fisher), se lavaron con series de tampones de lavado ChIP: tampón de lavado de baja sal, tampón de lavado de alta sal, tampón de lavado LiCl y tampón TE. Las muestras se eluyeron en SDS al 1% dos veces durante 15 minutos cada una a 65 °C. Se retiraron las perlas y tanto el material eluido como las muestras de entrada de lisado de células enteras al 5% se reticularon durante la noche a 65 °C. Tras normalizar el pH, las muestras se incubaron durante 30 min con RNasa (3 μg/mL) a 37 °C y durante 2 h con proteinasa K (20 mg/ml) y glucógeno (20 mg/ml) a 55 °C. El ADN se eluyó utilizando procedimientos estándar y los ChIP-ADN se analizaron mediante qPCR en comparación con las muestras de entrada utilizando los cebadores enumerados en la Tabla Suplementaria 2.

ELISA

El sobrenadante de las IntSCs de ratón cultivadas primariamente se cosechó después del estiramiento, y el sobrenadante se centrifugó durante 15 min. La concentración de VEGF-C en el sobrenadante se midió mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) con el kit ELISA específico para VEGF-C de ratón (CSB-E07361m, Cusabio).

Análisis morfométrico

Las mediciones morfométricas se realizaron utilizando el software ImageJ (NIH), el software ZEN 2012 (Carl Zeiss) o Imaris (Bitplane). Para la cuantificación de la superficie de las vellosidades, se estableció un umbral para las imágenes a analizar y se midió el área absoluta de las vellosidades LYVE-1+ para cada vellosidad dentro de la misma. La longitud absoluta de las vellosidades, la longitud absoluta de las vellosidades y la anchura absoluta de las vellosidades se midieron utilizando imágenes de inmunotinción de vellosidades E-cadherina+ o CD31+ o LYVE-1+ en cada uno de los campos aleatorios de 850 µm2 de la parte del intestino indicada. Para la cuantificación de la superficie, la longitud y la anchura de las vellosidades, se analizaron al menos 100 vellosidades a lo largo de todo el intestino delgado. La cuantificación de los siguientes parámetros en el intestino delgado se realizó en el yeyuno. Se midió el número de brotes lácteos y el número de ramificaciones lácteas en 10-20 vellosidades LYVE-1+ al azar. El número de LECs Prox1+ y el número de LECs Prox1+EdU+ se contaron manualmente en una longitud de 100 μm de 10-20 lacteales LYVE-1+ al azar. La cuantificación de las uniones de VE-cadherina+ de los lacteales se realizó con un objetivo ×40 en lacteales de 5-10 vellosidades por ratón. Brevemente, la unión tipo cremallera se definió como uniones continuas en los bordes célula-célula con células que tienen forma alargada51. La unión tipo botón se definió como uniones discontinuas que no son paralelas a los bordes célula-célula y la forma de la célula tipo hoja de roble. Las uniones que no corresponden a ninguno de los dos patrones se clasificaron como de tipo mixto. La intensidad de fluorescencia (FI) del BODIPY y su cuantificación se realizó como se ha descrito previamente34. El área de Oil red O se midió como el área de Oil red O+ dividida por el área de las vellosidades y se normalizó por la media de las de los ratones de control. El área de cobertura de células de músculo liso de las vellosidades se midió como el área de cobertura absoluta de αSMA+ en cinco campos de 850 µm2 por muestra, que luego se normalizó por la media de las de los ratones de control. Para cuantificar las expresiones relativas del VEGFR3 lácteo, se midió la media de FI en cinco campos de 425 µm2 por muestra y se presentó como valores relativos divididos por su control. Para determinar la densidad de los vasos sanguíneos, se midió el área de VEGFR2 en cinco campos de 425 µm2 por muestra y se presentó como valores relativos respecto a su control. El área de células T CD3+ o macrófagos F4/80+ se midió en cinco campos de 425 µm2 por muestra. La densidad de vasos linfáticos se calculó midiendo el área de LYVE-1+ en cinco campos aleatorios de 425-850 µm2 de muestras de montaje completo y se presentó como valores relativos a su control.

Secuenciación de ARN de células individuales basada en gotas

Las células individuales clasificadas se procesaron utilizando el 10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) siguiendo los protocolos del fabricante. Brevemente, las células clasificadas se resuspendieron en PBS con 0,5% de BSA y se mezclaron con la mezcla de reactivos RT y el cebador RT, que se añadieron a cada canal de los chips 10X, con un objetivo de 5000 células. Las células se separaron en perlas de gel en emulsión donde los transcritos de ARN de las células individuales se codificaron con barras y se transcribieron de forma inversa. Tras la construcción y amplificación de la biblioteca de ADNc, las moléculas de ADNc se fragmentaron enzimáticamente, se repararon los extremos y se les aplicó una cola A. Tras seleccionar el tamaño adecuado de las moléculas de ADNc procesadas mediante una selección de tamaño doble utilizando perlas SPRI (Beckman Coulter), se ligaron con un adaptador y se realizó la PCR de índice de muestra. Después de otra selección de tamaño doble utilizando perlas SPRI, las construcciones de bibliotecas finales se diluyeron 10 veces y se ejecutaron en el chip de alta sensibilidad Agilent Bioanalyzer para el control de calidad. A continuación, las bibliotecas unicelulares se secuenciaron utilizando la plataforma HiSeq-X de Illumina.

Preprocesamiento de los datos de ARN unicelular

Los datos de secuenciación en bruto se desmultiplexaron primero y se asignaron al genoma de referencia del ratón (mm10) utilizando el kit de herramientas Cell Ranger 3.0.2 de 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Utilizando el paquete R Seurat (versión 3.0.0)52, se construyeron matrices de expresión en bruto utilizando la función Read10X. Se excluyeron las células con menos de 1.000 genes detectados o con más de 6.000 genes detectados (consideradas como dobles potenciales) (Fig. 17a suplementaria). Además, las células con altos recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) asociados a genes mitocondriales (>7% del total) fueron consideradas como células muertas y, por tanto, excluidas. En cuanto a los genes, se eliminaron los expresados por menos de 3 células. Además, se excluyó un pequeño número de células inmunes Ptprc+ contaminantes y células endoteliales Pecam1+ Cdh5+ tras la ronda inicial de agrupación. Tras eliminar las células y los genes no deseados, los recuentos de UMI para cada gen de una célula se dividieron por la expresión total de una célula determinada y se multiplicaron por 10.000 y se transformaron en logaritmos. A continuación, los genes fueron escalados y centrados mediante la regresión de variables como el porcentaje de genes mitocondriales y el número de UMIs.

Identificación de genes variables y reducción de la dimensionalidad

Se utilizó el paquete Seurat de R para el análisis de agrupación. En primer lugar, se identificaron los genes altamente variables a través del conjunto de datos utilizando la función FindVariableFeatures en Seurat con la opción: selection.method = «vst». Se seleccionaron los 2000 genes con mayor variabilidad para el análisis posterior. Utilizando los genes variables identificados, se realizó una reducción inicial de la dimensionalidad mediante el análisis de componentes principales (PCA). Se utilizó la función JackStraw para determinar la significación estadística de las puntuaciones del PCA. Los 30 componentes principales (PC) más significativos se utilizaron como entrada para la Aproximación y Proyección Uniforme de Múltiples (UMAP) para reducir los datos a un espacio bidimensional.

Análisis de clústeres

Para agrupar las células por sus perfiles transcripcionales, realizamos un clúster no supervisado en los 2000 genes más variables de las cuatro muestras. Primero construimos un gráfico de vecinos cercanos compartidos (SNN) en el espacio de componentes principales utilizando la función FindNeighbors. A continuación, se aplicó el algoritmo de Louvain para la agrupación basada en la optimización de la modularidad utilizando la función FindClusters. Los parámetros de resolución de los clusters se fijaron en el punto en el que los clusters mostraban perfiles transcripcionales muy distintos. Las agrupaciones fueron independientes del número de genes detectados por célula (Fig. Suplementaria 17b). Los marcadores específicos de los clusters fueron genes expresados diferencialmente para cada cluster identificados a través de la función FindMarkers en Seurat con la siguiente configuración: min.pct = 0.3, logfc.threshold = 0.25, min.diff.pct = 0.15,test.use = «MAST». Los marcadores identificados con P ajustado < 0,05 se utilizaron para el análisis posterior. Dado que algunos tipos de células como las células musculares lisas y las células murales tenían marcadores bien conocidos, su aparición en la parte superior de la lista de marcadores para cada clúster validó nuestros procesos de selección de marcadores. Para eliminar fuentes de variación no deseadas, como el sexo, las células se dividieron según la presencia del transcrito específico femenino Xist y se integraron. Para llevar a cabo la integración de diferentes conjuntos de datos, primero normalizamos las matrices de expresión en bruto e identificamos los 2000 genes más variables para cada conjunto de datos. A continuación, utilizando la función FindIntegrationAnchors de Seurat, identificamos los anclajes entre los conjuntos de datos. A continuación, los conjuntos de datos se integraron basándose en los anclajes identificados mediante la función IntegrateData de Seurat. Los conjuntos de datos integrados se escalaron y se redujeron las dimensiones para su posterior análisis de conglomerados. Los clusters en los conjuntos de datos integrados fueron anotados por sus perfiles de expresión de los genes en las listas de creadores identificados.

Análisis de enriquecimiento de ontología genética

El análisis de enriquecimiento de ontología genética en los marcadores de clusters se realizó utilizando el paquete R goseq (versión 1.34.0)53. En función de la longitud del gen, se obtuvieron ponderaciones para cada gen y se utilizó la aproximación de Wallenius para identificar los términos de ontología genética asociados. Se seleccionaron los términos de ontología génica que tienen P ajustado < 0,05 y las categorías de procesos biológicos.

Estadística

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos fueron aleatorios y los investigadores fueron ciegos a la asignación durante los experimentos y los análisis de resultados. Todos los valores se presentan como media ± desviación estándar (DE). La significación estadística se determinó mediante la prueba U de Mann-Whitney de dos caras entre dos grupos o el ANOVA de dos vías con la prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak para la comparación de grupos múltiples. Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.