1 Teoría
Los oligonucleótidos se sintetizan mediante la adición de una base a la vez, que se extiende desde el extremo 3′ al 5′, unida a un soporte en fase sólida. Una vez finalizada la síntesis química del oligonucleótido, la cadena de ADN se libera del soporte sólido por incubación con hidróxido de amonio. El amonio también actúa como agente desprotector, escindiendo los grupos que protegen los fosfatos en los enlaces fosfodiéster. A continuación, se añade amoníaco caliente para hidrolizar los grupos protectores de los grupos amino exocíclicos de la desoxiadenosina, la desoxicitosina y la desoxiguanosina. El oligonucleótido podría suministrarse al usuario en la solución de amoníaco como una preparación cruda. En este caso, antes de su uso, puede ser necesario llevar a cabo un paso adicional para eliminar las sales y los subproductos de la preparación de oligonucleótidos generados durante la desprotección.
Después de la desprotección, la preparación de oligonucleótidos se suele desalar, cuantificar, evaporar hasta sequedad en un liofilizador y suministrar al usuario en forma de polvo. La solución de oligonucleótidos desalada contiene el oligonucleótido de longitud completa, pero también contiene una mezcla de productos truncados que se acumularon durante la síntesis química. El truncamiento se produce cuando la base especificada no se añade a la cadena en el ciclo correspondiente (Hecker & Rill, 1998). Así, el porcentaje de productos truncados acumulados en la preparación viene determinado por la eficiencia de la síntesis (la fracción de producto de longitud completa tras la síntesis) y la longitud de la molécula. Los oligonucleótidos largos, que requieren más ciclos de síntesis, son menos puros que los cortos. Estos fallos pueden competir con el producto de longitud completa en algunas aplicaciones y puede ser necesario eliminarlos antes de poder utilizar el oligonucleótido. Sin embargo, las preparaciones de oligonucleótidos desalados suelen ser adecuadas para muchas aplicaciones, como la PCR estándar o los microarrays, especialmente si el oligonucleótido tiene < 20 nucleótidos de longitud.
Se recomienda una purificación adicional para los oligonucleótidos de más de 50 bases porque el porcentaje de producto de longitud completa en la preparación no suele ser superior al 80%. Para aplicaciones exigentes en las que la longitud exacta del oligonucleótido es importante, como los ensayos de desplazamiento en gel, la mutagénesis dirigida al sitio, la secuenciación, la producción de adaptadores de clonación o la síntesis de ADNc de primera cadena para la generación de bibliotecas, se recomienda una purificación adicional, incluso para oligonucleótidos más cortos (véase más información sobre las técnicas anteriores en Ensayos estándar in vitro para interacciones proteína-ácido nucleico – Ensayos de desplazamiento en gel para la unión de ARN y ADN y mutagénesis dirigida al sitio).
La purificación puede ser necesaria después de la síntesis o después de la modificación enzimática del oligonucleótido. Hay varios métodos para conseguirlo, y la elección depende de la naturaleza del oligonucleótido y de la aplicación a la que se destina.
La purificación por HPLC en fase inversa se basa en la hidrofobicidad. Utiliza una fase estacionaria no polar y tampones acuosos y disolventes orgánicos como fase móvil para eluir los analitos; los compuestos polares se eluyen primero, mientras que los compuestos no polares se retienen. Este es el mejor método para purificar oligonucleótidos modificados con un grupo hidrofóbico, como la biotina, etiquetas de colorantes fluorescentes o conjugaciones NHS-éster. La recuperación de masa es mayor que cuando se utiliza la purificación PAGE y se presta a la purificación de mayores cantidades de oligonucleótidos (escala mmole), aunque no elimina tan eficazmente los productos incompletos. Los cartuchos de purificación de oligonucleótidos, basados en la cromatografía de fase inversa, proporcionan un método rápido de desalación y purificación de oligonucleótidos.
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) resuelve los oligonucleótidos en función de su longitud y, por tanto, ofrece una resolución suficiente para diferenciar los productos de longitud completa de las moléculas fallidas (Atkinson y Smith, 1984). Los geles de poliacrilamida son más eficaces para separar pequeños fragmentos de ADN que los geles de agarosa (véase Análisis del ARN mediante electroforesis analítica en gel de poliacrilamida y Electroforesis en gel de agarosa). La única desventaja de los geles de poliacrilamida es que son más difíciles de preparar y manipular que los geles de agarosa. Los geles de poliacrilamida se colocan en una configuración vertical en un campo eléctrico constante. Después de la electroforesis, el oligonucleótido se eluye del gel y se concentra, utilizando la precipitación con etanol (encuentre más información sobre la precipitación de los ácidos nucleicos en Purificación del ARN – métodos de precipitación) o la cromatografía en fase inversa. Este es el método de elección cuando se desea el mayor porcentaje de oligonucleótidos de longitud completa para aplicaciones exigentes. También es muy recomendable para oligonucleótidos de más de 30 bases. Además, se pueden ejecutar varias muestras simultáneamente y no se requiere un equipo costoso. El único inconveniente de esta técnica es la pequeña cantidad de oligonucleótidos que se obtiene por purificación. Normalmente, los oligonucleótidos se utilizan a escala de 1 μmol o menos, y la recuperación de masa tras la purificación PAGE es < del 50% e incluso menor en el caso de los oligonucleótidos modificados. No obstante, aunque el rendimiento es bajo, es satisfactorio para la mayoría de las aplicaciones bioquímicas.
La preparación de oligonucleótidos se carga en un gel de poliacrilamida desnaturalizante en una cantidad de al menos 1 mg por carril. El rango de resolución del gel depende de la concentración de poliacrilamida. Para oligonucleótidos cortos (de 15 a 35 bases), se recomiendan geles de poliacrilamida al 13-15%; para oligonucleótidos más largos (de 35 a 70 bases), se recomiendan geles de poliacrilamida al 8-13%. El porcentaje del gel debe adaptarse al sistema de funcionamiento. Normalmente utilizamos el sistema Bio-Rad Mini Protean II y corremos geles del 15% para purificar oligonucleótidos de 25 bases de longitud. Después de la identificación de la banda correcta por visualización UV, la banda se extirpa y se extrae del gel.
En este capítulo se describen dos métodos diferentes de purificación de oligonucleótidos a partir de geles de poliacrilamida. El método más sencillo es la elución mediante difusión. Se basa en el movimiento de las moléculas desde una región de mayor concentración a otra de menor concentración. El resultado de la difusión es una mezcla gradual del material. Este método lleva mucho tiempo, pero no requiere demasiada mano de obra ni ningún equipo. Básicamente, la banda de poliacrilamida que contiene el oligonucleótido de interés se corta en pequeños trozos y se cubre con tampón de elución. Tras la incubación, el ADN se purifica del sobrenadante por precipitación con etanol. El rendimiento es limitado, entre el 20% y el 70%, dependiendo de la longitud del oligonucleótido. Cuanto mayor sea la cantidad de tampón de elución utilizada, más oligonucleótido se difunde desde el gel.
El segundo método es la electroelución en una bolsa de diálisis (McDonell et al., 1977). El trozo de gel que contiene el oligonucleótido se extirpa y se coloca en una bolsa de diálisis con un tampón. La aplicación de una corriente eléctrica hace que el ADN migre fuera del gel al tampón de la bolsa de diálisis. El oligonucleótido se recupera de este tampón y se purifica. Con este método se puede aislar el oligonucleótido con un buen rendimiento, aunque consume mucho tiempo si se purifica un gran número de muestras al mismo tiempo, porque requiere la inserción de cada banda del gel en bolsas de diálisis individuales. Este método también funciona bien para fragmentos de ADN más grandes e incluso puede utilizarse para extraer ADN de geles de agarosa.