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El cromosoma Y humano se transmite directamente de padre a hijo en la mayor parte de su longitud, generando un patrón de herencia específico para los hombres que es distinto del resto del genoma. Por lo tanto, los rasgos fenotípicos del cromosoma Y deberían ser fácilmente reconocibles por su herencia en la línea masculina, y los primeros estudios afirmaban haber identificado varios de estos rasgos, incluyendo ejemplos notables como las «orejas peludas». Sin embargo, ya en 1957, el examen crítico de estas afirmaciones no encontró apoyo para ninguno de los 17 rasgos considerados,1 un hallazgo reforzado por el posterior análisis genético-molecular de las propias «orejas peludas».2 Esta quizás sorprendente falta de rasgos cromosómicos Y puede entenderse, al menos en parte, como consecuencia de dos factores. En primer lugar, cuando en 2003 se generó una secuencia de referencia para la región específica masculina del cromosoma Y humano,3 ésta reveló que el cromosoma porta pocos genes específicos para el hombre y codifica sólo 23 proteínas distintas. Trabajos posteriores han descubierto que tres de ellas están ausentes en aproximadamente el 2% de los hombres del sur de Asia, cuyos cromosomas Y codifican, por tanto, sólo 20 proteínas específicas para el hombre.4 En segundo lugar, el cromosoma Y tiene funciones especializadas en la determinación del sexo masculino y la fertilidad, en las que es poco probable que la variación mendeliana sea heredable. Por ello, a principios de 2004 se podía escribir que «el análisis de pedigrí aún no ha revelado un solo gen ligado al Y».5 Sin embargo, ese mismo año se informó de la existencia de una discapacidad auditiva ligada al Y (DFNY1, MIM 400043) en una familia china6 y sigue siendo el único trastorno mendeliano documentado que muestra un vínculo con el Y en los seres humanos. Por lo tanto, su base parece ser inusual y es de considerable interés. Aquí, investigamos esta base examinando la secuencia del cromosoma Y de DFNY1 y comparándolo con el cromosoma Y de una rama de la familia estrechamente relacionada pero no afectada.
En el pedigrí de DFNY1 de siete generaciones comunicado en 2004, todos los varones adultos estaban afectados.6 Posteriormente, el pedigrí se remontó dos generaciones más, y se identificaron descendientes adicionales de la línea masculina de un ancestro anterior.7 Sorprendentemente, su audición no estaba afectada (Figura 1). Anteriormente habíamos demostrado la identidad de los cromosomas Y de las dos ramas de la familia en 67 loci Y-STR, por lo que razonamos que la diferencia fenotípica entre las ramas debía estar asociada a una variante genética portada específicamente por el cromosoma Y de la rama afectada. Seleccionamos un cromosoma Y representativo de cada rama mediante citometría de flujo y luego lo secuenciamos. Sólo se identificaron cuatro diferencias de base entre los cromosomas.8 Tres de ellas habían surgido en la rama no afectada. La cuarta había surgido en la rama afectada y se segregaba con el fenotipo, pero era una mala candidata para la mutación causal porque estaba fuera de cualquier gen anotado. Aunque este análisis no pudo evaluar las regiones repetidas del cromosoma, los genes repetidos conocidos están implicados principalmente en la espermatogénesis,3,9 por lo que en el presente estudio hemos explorado la posibilidad de que la mutación causal no sea una mutación puntual. Este estudio fue aprobado por los donantes de las muestras, que dieron su consentimiento informado por escrito, y por el Comité de Ética Médica del Hospital General del Ejército Popular de Liberación de China, Pekín, China.
El pedigrí del DFNY1
Machos, cuadrados; mujeres, círculos; línea diagonal, fallecido. Los símbolos rellenos indican una discapacidad auditiva (incluso a partir de los registros familiares); los signos de interrogación indican dos individuos cuyo fenotipo auditivo se desconoce; y los asteriscos indican los individuos que están en la rama afectada pero que estaban por debajo de la edad de inicio de los síntomas en el momento del examen. Las flechas indican los dos individuos cuyos cromosomas Y fueron secuenciados. El reordenamiento estructural se produjo durante una de las cuatro meiosis marcadas con estrellas rojas. Se omiten los cónyuges en las generaciones VII-IX y en la generación VI en la rama no afectada.
Examinamos la profundidad relativa de las lecturas a lo largo del cromosoma alineando las lecturas de alta calidad filtradas por duplicación con la secuencia de referencia chrY utilizando el Algoritmo de Búsqueda de Secuencia y Alineación por Hashing 2 (SSAHA2)10 y comparando el número de lecturas por cada cubo de 10 kb entre los cromosomas Y del individuo afectado VIII-2 (Figura 1) y del individuo no afectado VII-24 (Figura 1). Esto reveló tres segmentos discontinuos duplicados en el cromosoma afectado, y todos se derivaban de la región limitada entre el clúster del gen TSPY1 (MIM 480100) que termina en ∼9,3 Mb y el hueco centromérico en ∼10,1 Mb (Figura 2A). Estas duplicaciones se confirmaron mediante hibridación genómica comparativa (CGH) convencional con una matriz Agilent de 1 millón que cubría todo el genoma y una matriz NimbleGen 385K personalizada que abarcaba las posiciones chrY: 2.000.000-10.715.000 (1.990.000-10.105.000 hg19) a alta (∼20 pb) resolución (Figura 2B). Dado que incluían parte del clúster del gen TSPY1, verificamos un aumento del número de genes TSPY1 mediante qPCR (Tabla S1 en los Datos Suplementarios disponibles en línea) y electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE; Figura S1). Estos análisis mostraron que la duplicación era compartida por todos los miembros de la familia afectados analizados y estaba ausente en todos los miembros no afectados, y también que la duplicación se encontraba en un fragmento de restricción separado del grupo original de TSPY1 y, por tanto, no era contiguo. Aunque las pruebas combinadas confirmaron una duplicación compleja de la región de 9,3-10,1 Mb, no proporcionaron información sobre dónde se insertaron las secuencias duplicadas. La hibridación fluorescente in situ (FISH) en metafase con una sonda TSPY1 mostró una única señal (no mostrada), por lo que utilizamos fiber-FISH como se ha descrito previamente11 para obtener una mayor resolución. Las sondas del cromosoma Y eran clones BAC que abarcaban la mayor parte de ∼9,3-10,1 Mb de la secuencia de referencia: RP11-334D2 (incluyendo TSPY1), RP11-182H20, RP11-155J5, RP11-160K17 y RP11-108I14 (incluyendo las secuencias centroméricas). Los resultados (Figura 2C) mostraron que el cromosoma no afectado estaba organizado de la misma manera que la secuencia de referencia, que puede resumirse como TSPY1-182H20-centrómero. Por el contrario, el cromosoma afectado (Figura 2D) se interrumpió dentro de la secuencia 182H20 para producir la organización TSPY1-parcial 182H20-gap- duplicación centromérica-TSPY1 duplicación-182H20-centrómero. Los resultados de fiber-FISH demostraron así que las secuencias Y duplicadas se reinsertaron localmente en una forma reordenada, pero también revelaron la presencia de un segmento que no hibridó con ninguna sonda de la región TSPY1-centrómero.
Caracterización del reordenamiento estructural llevado a cabo por el cromosoma Y de DFNY1
(A) Profundidad de lectura relativa (afectada/no afectada) en intervalos de 10 kb mapeados a la secuencia de referencia del cromosoma Y entre 9,3 y 10,1 Mb. Nótense los huecos de ensamblaje en cada extremo de esta región.
(B) Relación log2 de CGH (afectado/no afectado) para la misma región.
(C) Fiber-FISH de los tres clones BAC indicados al cromosoma Y no afectado, mostrando que lleva la estructura de referencia en esta región. Tanto el 334D2 como el 108I14 detectan matrices en tándem más grandes que el tamaño del clon BAC.
(D) Fiber-FISH de los mismos clones BAC al cromosoma Y afectado. Este cromosoma lleva una inserción que interrumpe la región de hibridación 182H20 y contiene duplicaciones parciales de las secuencias de hibridación 334D2- y 108I14.
(E) Profundidad de lectura absoluta de las lecturas del cromosoma Y no afectado y afectado a la región de 160.15-160,35 Mb de la secuencia de referencia del cromosoma 1.
(F) Relación log2 de CGH (afectado/no afectado) para la misma región del cromosoma 1.
(G) FISH en metafase del clon BAC 179G5 del cromosoma 1 en el cromosoma Y no afectado (amarillo). La hibridación se ve sólo en la ubicación de referencia en el cromosoma 1.
(H) FISH en metafase de la misma sonda del cromosoma 1 en el cromosoma Y afectado (amarillo). Se observa hibridación en un locus adicional del cromosoma Y.
(I) FISH de fibra de los dos clones BAC de Y indicados más los clones del cromosoma 1 574F21, 179G5 y 1365F20 al cromosoma Y no afectado. No se detecta ninguna señal del cromosoma 1 en el Y.
(J) Fiber-FISH de los mismos clones al cromosoma Y no afectado. Los clones del cromosoma 1 detectan una señal en el Y entre la señal parcial 182H20 y la señal 108I14. Las coordenadas del genoma se refieren a GRCh37/hg19.
Para identificar estas secuencias desconocidas, realizamos una PCR asimétrica térmica entrelazada (TAIL-PCR)12 en el segmento que se extiende desde el punto de rotura 182H20 hasta la brecha utilizando los cebadores mostrados en la Tabla S2. En amplificaciones consecutivas, este procedimiento empareja cebadores anidados específicos para la secuencia conocida con cebadores degenerados que se espera que ceben en la secuencia flanqueante desconocida. Los productos de unión candidatos se reconocen porque sus diferencias de tamaño en las reacciones consecutivas reflejan las posiciones de los cebadores conocidos. Las secuencias adyacentes, confirmadas con cebadores específicos del punto de rotura (Tabla S3 y Figuras S2 y S3), procedían del cromosoma 1 (160,16 Mb), y el examen de la profundidad de las lecturas, los perfiles de CGH (Figuras 2E y 2F) y la secuencia sugerían la implicación de una región contigua de ∼160 kb; dicha implicación estaba respaldada por la identificación de una segunda unión cromosómica 1-Y más compleja en 160,32 Mb. La translocación de las secuencias del cromosoma 1 al Y afectado fue confirmada por FISH en metafase (Figuras 2G y 2H), y su localización dentro del hueco de la duplicación del Y fue confirmada por fiber-FISH (Figuras 2I y 2J) con los BACs RP11-574F21, RP11-179G5, y W12-1365F20 del cromosoma 1 como sondas. Los datos combinados revelaron así una compleja estructura de duplicación que consistía tanto en un fragmento del cromosoma 1 como en múltiples segmentos de ADN Y (Tabla S4 y Figuras S2 y S3). Ninguno de los puntos de rotura secuenciados mostraba longitudes extensas de homología, pero todos revelaban microhomología, un patrón indicativo de FoSTeS (fork stalling and template switching), que es un mecanismo que combina fragmentos genómicos dispares durante la replicación.13
La estructura duplicada observada aquí no ha sido reportada en otros lugares y debe haber surgido durante una de las cuatro meiosis, que abarcan la meiosis en la que se produjo la propia mutación DFNY1 (Figura 1). Por lo tanto, es probable que sea causal. Las secuencias duplicadas del cromosoma Y codifican sólo una proteína conocida, TSPY1, de un conjunto en tándem de ∼10 genes TSPY1, mientras que las secuencias del cromosoma 1 llevan cinco genes RefSeq (CASQ1 , PEA15 , DCAF8 , PEX19 , y COPA ) y el extremo 5′ de otro gen, NCSTN (MIM 605254) (exones 1-3; Figura 3). Los mecanismos por los que la duplicación podría conducir al fenotipo de sordera incluyen un aumento en el número de copias del gen, una expresión inapropiada resultante de un nuevo ADN flanqueante, o la formación de un producto alterado por truncamiento, fusión o mutación puntual. No se dispone de datos de expresión de la familia DFNY1, y no se encontraron mutaciones no sinónimas en los genes del cromosoma 1 RefSeq (Tabla S5). El número de copias de TSPY1 es polimórfico dentro de la población,14 y se han encontrado números mayores de copias de TSPY1 sin que se haya informado de sordera, incluso en individuos 47,XYY; un estudio asoció el número elevado de copias de TSPY1 con un fenotipo diferente, la infertilidad.15 El número elevado de copias de TSPY1 proporciona, por tanto, un candidato pobre para la sordera. Por el contrario, la región del cromosoma 1 se encuentra enteramente dentro de un intervalo de aproximadamente 900 kb, DFNA49 (MIM %608372), previamente asociado con la pérdida de audición; la mutación causal en este intervalo sigue siendo desconocida.16 Por lo tanto, proponemos que el mismo gen o genes podrían ser la base de los fenotipos DFNA49 y DFNY1. El mecanismo más parsimonioso sería la sensibilidad a la dosis de uno o más de estos genes, de manera que el aumento de la expresión resultante de tres copias conduce a la pérdida de audición, aunque no se excluyen otros mecanismos.
Estructura y contenido génico de los cromosomas Y no afectados y afectados
(A) La estructura del cromosoma Y no afectado (VII-24 en la figura 1). Gris y negro: errores y huecos, respectivamente, en el ensamblaje GRCH37. Azul: región que coincide con la secuencia de referencia en el nivel de resolución utilizado. A continuación se muestra parte de la matriz TSPY1 (puntas de flecha azules) y la ubicación de las señales de los clones BAC identificados en la Figura 2.
(B) Estructura del cromosoma Y afectado (VIII-2 en la Figura 1). Este cromosoma contiene un segmento que no está en el cromosoma no afectado; este segmento deriva de duplicaciones de secuencias tanto del cromosoma 1 (amarillo) como del cromosoma Y (azul). De nuevo, el contenido de los genes y las señales del BAC se muestran a continuación. Las puntas de flecha de arriba indican la orientación de los segmentos duplicados en relación con la secuencia de referencia.
(C) Vista detallada de las dos uniones del cromosoma 1-Y estudiadas a nivel de secuencia (Figuras S2 y S3), mostrando la diferencia entre la estructura simple de la unión 1 y la estructura compleja de la unión 2.
Encontramos que la causa del trastorno mendeliano ligado al Y humano estaba asociada a la inserción de secuencias del cromosoma 1 más que a la mutación de un gen cromosómico Y. Esto es coherente con las observaciones de que ni la duplicación (cariotipo 47,XYY) ni la deleción (cariotipo 45,X) de todo el cromosoma Y y, por tanto, de todos sus genes, se asocia con la discapacidad auditiva, lo que implica que es poco probable que la pérdida de función o la duplicación de un gen del cromosoma Y subyazca al fenotipo DFNY1. La complejidad del reordenamiento también es coherente con su rareza: Aunque la sordera de línea masculina debería ser un fenotipo fácilmente reconocible, hasta donde sabemos sólo se ha informado de una única familia adicional con un fenotipo similar.17 Se desconoce la relación entre las dos familias; la segunda familia también es china, pero de un grupo étnico diferente (Tujia en lugar de Han). Sin embargo, las características audiológicas son similares, y sobre la base de los conocimientos actuales es imposible excluir un origen común. A pesar de la rareza de este reordenamiento específico, consideramos que la adquisición de secuencias autosómicas por parte del cromosoma Y es una parte estándar de la evolución del cromosoma Y, normalmente neutra y que ocasionalmente alcanza la fijación, aunque en el caso del DFNY1 es desventajosa. De hecho, cabe destacar que el cromosoma Y lleva una inserción fija de ∼100 kb de la región cromosómica 1q43 en Yq proximal,18 cerca de la inserción DFNY1. Esta observación plantea la cuestión de si la proximidad en el núcleo podría favorecer la transferencia de ADN entre estos dos cromosomas.19 El mecanismo mutacional propuesto para el DFNY1, FoSTeS, se ha asociado anteriormente sólo con reordenamientos intracromosómicos,13 por lo que el estudio actual amplía su influencia para incluir reordenamientos intercromosómicos; también pone de manifiesto la necesidad de comprender mejor la descuidada relación entre la variación del número de copias y la discapacidad auditiva.20