Des sous-ensembles distincts de fibroblastes régulent l’intégrité lactique par le biais du VEGF-C induit par YAP/TAZ dans les villosités intestinales

Animaux d’expérience

Tous les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été conformes à toutes les réglementations éthiques pour la recherche et l’expérimentation animale sous l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (n°. KA2016-12) du Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Les souris Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 et Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 ont été transférées, établies et élevées dans des animaleries spécifiquement exemptes de pathogènes (SPF) au KAIST. Les souris C57BL/6 J, R26-tdTomato et Myh11-Cre-ERT2 ont été achetées au Jackson Laboratory. Toutes les souris ont été maintenues dans le fond C57BL/6 et nourries avec un accès libre à un régime standard (PMI LabDiet) et à de l’eau. Afin d’induire l’activité Cre chez les souris Cre-ERT2, 2 mg de tamoxifène (Sigma-Aldrich) dissous dans de l’huile de maïs (Sigma-Aldrich) ont été injectés par voie intrapéritonéale (i.p.) aux points de temps indiqués pour chaque expérience. Les souris Cre-ERT2 négatives mais flox/flox-positives parmi les compagnons de portée ont été définies comme des souris témoins (WT) pour chaque expérience. Les souris ont été anesthésiées par injection i.p. d’une combinaison d’anesthésiques (80 mg/kg de kétamine et 12 mg/kg de xylazine) avant d’être sacrifiées.

Analyses histologiques

Pour la coloration en montage entier de l’intestin grêle, une perfusion transcardiaque a été réalisée avec 2% de paraformaldéhyde (PFA) après anesthésie. L’intestin grêle a été récolté et coupé longitudinalement pour exposer la lumière. Après plusieurs lavages avec du PBS, les intestins ont été fixés sur des plaques de silicium. Les échantillons ont ensuite été post-fixés à 4 °C dans du PFA à 4 % pendant 2 h. Les échantillons ont été lavés plusieurs fois avec du PBS et ont ensuite été déshydratés avec du saccharose à 10 % dans du PBS pendant 2 h et avec du saccharose à 20 % et du glycérol à 10 % dans du PBS pendant une nuit. La peau de l’oreille, la trachée et le diaphragme ont été prélevés sans perfusion transcardiaque et fixés dans du PFA à 4% pendant 1 h à 4 °C. Les échantillons ont été lavés avec du PBS plusieurs fois avant d’être bloqués. Après blocage avec du sérum de chèvre ou d’âne à 5 % dans du Triton-X 100 à 0,5 % dans du PBS (PBST) pendant 1 h, les échantillons ont été incubés avec les anticorps primaires indiqués dilués dans la solution de blocage à 4 °C pendant la nuit. Après plusieurs lavages avec PBST, les échantillons ont été incubés pendant 2 h à température ambiante (RT) avec les anticorps secondaires conjugués au fluorocrome indiqués, dilués dans le tampon de blocage. Les échantillons ont été lavés avec du PBST et les noyaux ont été colorés avec du DAPI (Invitrogen). Après lavage avec du PBS, les échantillons ont été montés avec du Vecta-shield (Vector Laboratories). Les images ont été obtenues à l’aide du microscope confocal Zeiss LSM 800 ou LSM 880 (Carl Zeiss).

Les anticorps primaires et secondaires suivants ont été utilisés pour l’immunomarquage : anti-LYVE-1 (polyclonal de lapin, 11-034, Angiobio, 1:400) ; anti-CD31 (monoclonal de rat, 557355, BD Biosciences, 1 :400) ; anti-CD31 (monoclonal hamster, MAB1398Z, Merck, 1:400) ; anti-E-cadhérine (polyclonal chèvre, AF748, R&D, 1:200) ; anti-Prox1 (polyclonal chèvre, AF2727, R&D, 1 :400) ; anti-Prox1 (polyclonal de lapin, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400) ; anti-VE-cadhérine (polyclonal de chèvre, AF1002, R&D, 1:200) ; anti-PDGFRβ (monoclonal de rat, ab91066, Abcam, 1 :200) ; anti-PAI-1 (monoclonal de souris, sc-5297, Santa Cruz, 1:100) ; anti-Serpina3n (polyclonal de chèvre, AF4709, R&D, 1:200) ; anti-Fosb (monoclonal de lapin, 2251, Cell Signaling Technology, 1 :400) ; anti-Shisa3 (polyclonal de lapin, TA320118, Origene, 1:400) ; anti-P2X1 (polyclonal de lapin, APR-001, Alomone labs, 1:800) ; anti-Ackr4 (polyclonal de lapin, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1 :200) ; anti-Grem1 (polyclonal de chèvre, AF956, R&D, 1:200) ; anti-Sox6 (polyclonal de lapin, ab30455, Abcam, 1:400) ; anti-PDGFRα (polyclonal de chèvre, AF1062, R&D, 1 :200) ; anti-YAP (monoclonal de lapin, 14074, Cell signaling, 1:200) ; anti-TAZ (polyclonal de lapin, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200) ; anti-αSMA, conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (monoclonal de souris, F3777, Sigma-Aldrich, 1 :1000) ; anti-VEGFR3 (polyclonal de chèvre, AF743, R&D, 1:200) ; anti-VEGFR2 (polyclonal de chèvre, AF644, R&D, 1:200) ; anti-PGP9.5 (monoclonal de lapin, 13179, Cell signaling, 1:400) ; anti-F4/80, conjugué au FITC (monoclonal de rat, 1231007, Biolegend, 1:200) ; anti-CD3 (monoclonal de hamster, 553058, BD Biosciences, 1:1000) ; anti-Desmin (polyclonal de lapin, AB907, Millipore, 1 :400) ; et des anticorps secondaires anti-lapin, anti-rats, anti-chèvres, anti-hamster conjugués à Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647 (dilués à un ratio de 1:1000) ont été achetés chez Jackson ImmunoResearch. Tous les anticorps utilisés dans notre étude ont été validés pour les espèces et les applications.

L’hybridation in situ en fluorescence monomoléculaire (smFISH)

Pour la smFISH de l’intestin grêle, une perfusion transcardiale a été réalisée avec 2% de PFA après anesthésie. Les échantillons ont été post-fixés à 4 °C dans du PFA à 4 % pendant 2 h. Les échantillons ont été lavés avec du PBS plusieurs fois, déplacés dans du saccharose à 30 % et incubés pendant la nuit. Les échantillons inclus dans l’OCT ont été sectionnés, et nous avons réalisé le smFISH selon le protocole du fabricant qui est décrit dans le kit RNAscope Fluorescent Multiplex Assay (320850, ACDBio). La sonde RNAscope (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) a été utilisée pour le smFISH. Les anticorps primaires et secondaires suivants ont été utilisés pour les immunomarquages avec smFISH : anti-PDGFRβ (monoclonal de rat, ab91066, Abcam) ; anti-Shisa3 (polyclonal de lapin, TA320118, Origene) ; anti-P2X1 (polyclonal de lapin, APR-001, Alomone labs) et des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647 ont été achetés chez Jackson ImmunoResearch. Les images ont été obtenues à l’aide du microscope confocal Zeiss LSM 800 ou LSM 880 (Carl Zeiss).

Le test d’incorporation de l’EdU pour les LEC en prolifération

Pour détecter les LEC en prolifération dans le lactaire, 5 mg de 5-éthynyl-2′-deoxyuridine (EdU, A10044, Invitrogen) ont été dissous dans 1 ml d’eau Milli-Q comme solution mère. Ensuite, 200 μl de la solution mère par souris ont été injectés i.p. tous les deux jours pendant une semaine avant l’analyse. L’intestin grêle a été isolé et traité comme décrit ci-dessus. Les cellules incorporées à l’EdU ont été détectées avec le kit de dosage Click-iT EdU Alexa Fluor-488 (Invitrogen) selon le protocole du fabricant.

Microscopie électronique

Pour capturer des images de microscopie électronique à ultrastructure du lactaire, l’intestin grêle a été sectionné après perfusion transcardiaque avec du PFA à 4% et du glutaraldéhyde à 0,25% dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4). Les échantillons ont ensuite été fixés pendant une nuit dans du glutaraldéhyde à 2,5 %, post-fixés avec du tétroxyde d’osmium à 1 %, et déshydratés avec une série de concentrations croissantes d’éthanol, puis inclus dans de la résine. Des sections ultrafines de lactaires de 70 nm ont été obtenues à l’aide d’un ultramicrotome (UltraCut-UCT, Leica), qui ont ensuite été recueillies sur des grilles de cuivre. Les échantillons ont été imagés par EM en transmission (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) à 120 kV après coloration avec de l’acétate d’uranyle à 2% et du citrate de plomb.

Imagerie intravitale de la clairance des lipides de la lamina propria

Les souris ont été anesthésiées après retrait de la nourriture pendant 12 h avant la procédure. L’imagerie intravitale a été réalisée comme nous l’avons décrit précédemment34. En bref, les sondes lipidiques BODIPY (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) ont été dissoutes dans une solution de DMSO à 2,5 % (Sigma-Aldrich). Un anticorps anti-LYVE-1 (monoclonal de rat, 223322, R&D) conjugué à l’Alexa Fluor 647 (Invitrogen) (0,75 mg/kg) a été injecté par voie intraveineuse 12 heures avant l’imagerie pour le marquage fluorescent des lactaires. Ensuite, le jéjunum proximal a été extériorisé dans une chambre d’imagerie où la température a été maintenue à 37 °C pendant l’imagerie. Après une ouverture chirurgicale de la lumière intestinale de 1,5 cm le long du bord antimésentérique, un verre de couverture a été placé sur la lumière exposée pour obtenir une vue des villosités. L’imagerie intravitale a été réalisée en trois sessions. Les villosités ont d’abord été imagées avant l’apport de BODIPY-FA à 0 min. Ensuite, 30 μl de sondes lipidiques BODIPY ont été fournis une fois avant la deuxième session d’imagerie pour observer l’absorption initiale des lipides BODIPY à 1 min. Ensuite, les lipides BODIPY ont été fournis trois fois à 2 min d’intervalle avant la troisième session d’imagerie à 26 min, et la clairance du BODIPY-FA à travers les lactaires a été analysée à 36 min et 46 min. On a utilisé un microscope confocal à balayage laser de fabrication artisanale34. Deux lasers à ondes continues émettant à 488 nm (MLD, Coherent) et 640 nm (Cube, Coherent) ont été utilisés comme sources d’excitation pour l’imagerie de fluorescence. Deux filtres passe-bande (FF01-525/50 et FF01-685/40, Semrock) ont été utilisés pour la détection des signaux fluorescents. La résolution axiale inférieure à 4 μm a été acquise avec un sténopé de 100 μm et un objectif 60x (LUMFLN, immersion dans l’eau, NA 1,1, Olympus). Les images (512 × 512 pixels) ont été obtenues à une fréquence d’images de 30 Hz. Pour améliorer le rapport signal/bruit de l’image, le bruit sur 90 images après post-traitement des images en temps réel (30 images/sec) a été moyenné en supprimant l’artefact de mouvement généré par le péristaltisme avec un programme MATLAB écrit sur mesure. Le logiciel ImageJ (NIH) a été utilisé pour mesurer l’intensité fluorescente moyenne dans la lamina propria.

Test d’absorption des lipides

Après suppression des aliments pendant 12 h, 200 μl d’huile d’olive (Sigma-Aldrich) ont été délivrés par gavage oral pour la mesure des triglycérides plasmatiques et la coloration Oil Red O. Le sang a été prélevé par la veine de la queue dans le tube de prélèvement sanguin contenant de l’héparine à 0, 1, 2, 3 et 4 h après l’administration d’huile d’olive. La concentration de triglycérides dans le plasma a été mesurée à l’aide d’un analyseur VetTest Chemistry (IDEXX Lab). L’intestin grêle a été coloré avec de l’Oil red O 12 h après le gavage à l’huile d’olive en suivant le protocole du fabricant de l’Oil Red O Staining Kit (MAK194, Sigma-Aldrich). L’alimentation avec un régime riche en graisse (HFD) (60% kcal de graisse, Research Diets, D12492) a commencé à l’âge de 12 semaines et s’est poursuivie pendant 8 semaines pour la mesure des triglycérides plasmatiques et la coloration à l’Oil Red O. Le sang a été prélevé par la veine de la queue dans un tube de prélèvement sanguin contenant de l’héparine après 6 heures de jeûne. Pour la coloration à l’Oil red O des sections de foie, le foie a été récolté, fixé dans du PFA à 4% pendant une nuit à 4 °C, a été coupé en sections vibratome de 100 μm (Leica, VT1200S), a été coloré à l’Oil red O.

Transduction de l’AAV

Les souris indiquées ont reçu une seule dose i.p. dose (1012 particules virales dans 150-200 µl) d’un AAV recombinant codant pour les domaines de liaison au ligand 1-4 du VEGFR3 fusionnés au domaine Fc des IgG (AAV-mVEGFR31-4-Ig), et les souris témoins ont reçu la même dose d’AAV codant pour les domaines 4-7 du VEGFR3, qui ne lient pas le VEGF-C ou le VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), fusionnés au domaine Fc des IgG, comme décrit précédemment37. AAV-mVEGFR31-4-Ig et AAV-mVEGFR34-7-Ig ont été détectés dans le sérum par analyse d’immunoblotting (anticorps anti-VEGFR3 ; polyclonal de chèvre, AF743, R&D) de 0.5 μl d’échantillons de sérum collectés le jour même de l’analyse intestinale.

Traitement de l’anticorps

Pour le blocage du VEGFR2, nous avons utilisé un anticorps neutralisant le VEGFR2 (DC101). Une lignée cellulaire d’hybridome qui produit le DC101 a été achetée auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules d’hybridome ont été cultivées dans un milieu sans sérum. Les protéines recombinantes présentes dans les surnageants ont été purifiées par chromatographie sur colonne avec un gel d’agarose de type Protéine A (Oncogene). Après purification, les protéines recombinantes ont été quantifiées à l’aide du test Bradford et confirmées par coloration au bleu de Coomassie après électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) au dodécylsulfate de sodium (SDS). DC101 (50 mg/kg) ou une quantité égale de l’anticorps témoin (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) a été injecté par voie i.p. aux souris indiquées tous les 2 jours pendant 2 semaines.

Enrichissement des LEC intestinaux et isolement des IntSC à partir de l’intestin grêle

La séreuse, la couche musculaire et les tissus adipeux mésentériques ont été retirés de l’intestin grêle. Après avoir ouvert les fragments d’intestin longitudinalement et les avoir lavés avec du PBS, les échantillons ont été coupés en morceaux de 2 cm, et les plaques de Peyer ont été retirées. Les échantillons ont été lavés avec du PBS et incubés avec de l’EDTA 10 mM avec du DMEM sans calcium et magnésium (Gibco) sur de la glace pendant 20 minutes. Les tissus ont été passés au vortex avec du PBS sans calcium jusqu’à l’obtention d’un surnageant clair, dépourvu de cellules épithéliales. Les échantillons ont été découpés en fragments de 1 mm et dissociés avec un tampon de dissociation contenant 2 mg/ml de collagénase II (Worthington), 1 mg/ml de Dispase (Gibco) et 1 U/ml de DNase (Invitrogen) dans du DMEM à 37 °C pendant 30 minutes. Pour faciliter la dissociation, les morceaux de tissus ont été doucement pipetés de haut en bas toutes les 10 minutes. Les échantillons ont ensuite été filtrés à travers une crépine de 70 μm pour désagréger mécaniquement les fragments intestinaux restants. Après avoir recueilli les surnageants, un volume égal de DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) a été ajouté. Après centrifugation, les cellules ont été remises en suspension dans du PBS. Pour enrichir la fraction de cellules stromales et les LEC, les cellules hématopoïétiques et les cellules épithéliales ont été éliminées à l’aide d’AutoMACS (Miltenyi) après incubation pendant 15 minutes sur glace avec des microbilles anti-CD45 et anti-CD326 (Miltenyi). Pour l’isolement des IntSC, des Microbilles anti-CD31 (Miltenyi) ont été ajoutées pour épuiser les cellules endothéliales en plus des Microbilles anti-CD45 et anti-CD326.

Culture primaire des IntSC de souris

Après l’isolement des IntSC, les cellules ont été cultivées avec du DMEM/F12 contenant 10% de FBS sur une plaque de culture tissulaire pendant 24 h ou 2 jours. Pour les traitements médicamenteux et la coloration par immunofluorescence, 50 000 cellules par puits ont été placées sur des lames de chambre Nunc Lab-Tek II à 4 puits (Sigma-Aldrich). Les concentrations de médicaments sont décrites dans les légendes des figures indiquées et les traitements ont duré 6 heures pour l’immunofluorescence et l’analyse de l’expression génétique. Un plat d’imagerie de 35 mm avec une surface à support élastique (Ibidi) a été utilisé pour la culture d’IntSC sur des matrices molles (1,5 kPa) et rigides (28 kPa) pendant 24 h. Pour l’induction de l’activité cre dans les IntSC en culture primaire dérivées de souris WT ou Yap/Tazi∆FRC, les cellules ont été traitées avec 5 µM de 4-hydroxy-tamoxifène (4-OHT) dans de l’éthanol (EtOH) à 100 % ou de l’EtOH à 100 % seul pendant 2 jours comme contrôle. Des monocouches d’IntSCs expansées en culture et validées comme PDGFRβ+ ont été utilisées pour les expériences.

Cytométrie en flux et tri cellulaire

Pour trier les IntSCs PDGFRβ+ ou les LECs intestinaux, les fractions enrichies sont passées en lyse RBC par suspension dans le tampon de lyse ACK (Gibco) pendant 5 min à RT. Après avoir bloqué les récepteurs Fcγ avec des anti-CD16/CD32 de souris (553141, BD Bioscience), les cellules ont été incubées pendant 15 min avec les anticorps indiqués dans un tampon FACS (2% FBS dans PBS). Après plusieurs lavages, les cellules ont été analysées par FACS Canto II (BD Biosciences) et les données acquises ont été évaluées à l’aide du logiciel FlowJo (Treestar). Le tri cellulaire a été effectué avec le FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Les cellules mortes ont été exclues en utilisant la coloration DAPI (Sigma-Aldrich) et les doublets de cellules ont été systématiquement exclus. L’intensité de la fluorescence est exprimée en unités arbitraires sur une échelle logarithmique, et la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale sont représentées sur une échelle linéaire. Les anticorps suivants ont été utilisés pour la cytométrie de flux : FITC anti-souris CD45 (11-0451-85, monoclonal de rat, Biolegend) ; FITC anti-souris TER-119 (11-5921-85, monoclonal de rat, Biolegend) ; APC anti-souris CD31 (551262, monoclonal de rat, BD Bioscience) ; et PE/Cy7 anti-souris Podoplanin (127412, monoclonal de hamster syrien, Biolegend).

Séquençage de l’ARN en vrac

Le séquençage de l’ARN en vrac des IntSC PDGFRβ+ isolés a été réalisé en obtenant le fichier d’alignement. En bref, les lectures ont été mappées à l’aide de l’outil logiciel TopHat. Le fichier d’alignement a été utilisé pour assembler les transcrits, estimer leurs abondances et détecter l’expression différentielle des gènes ou des isoformes à l’aide de brassards. L’outil Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) a été utilisé pour évaluer davantage les données dans le contexte de la signalisation canonique et pour déterminer si les gènes hyperactivés par YAP/TAZ étaient spécifiquement liés aux molécules sécrétoires. L’importance de la signalisation canonique a été testée par la procédure de Benjamini-Hochberg, qui ajuste la valeur P pour corriger les comparaisons multiples, et leur activation ou inhibition a été déterminée par rapport aux z-scores d’activation. L’analyse des clusters et les cartes thermiques ont été générées à l’aide de Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Pour la GSEA, les collections de jeux de gènes de la base de données Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/) ont été utilisées.

MEFs et HDLECs

Les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) ont été isolés à partir d’embryons E12,5 comme décrit précédemment32. En bref, les tissus de la tête, des membres et du cœur ont été retirés et les échantillons ont été hachés avec des ciseaux et digérés avec 0,1 % de trypsine/EDTA avec DNase (1 U/ml, Invitrogen) à 37 °C pendant 20 minutes. Après la digestion et l’élimination des tissus non digérés, les cellules ont été brièvement essorées, placées sur un plat de 10 cm et laissées croître jusqu’à la subconfluence. Les MEF ont ensuite été maintenues dans du DMEM/F12 contenant 10% de FBS. Les cellules endothéliales lymphatiques dermiques humaines (HDLEC) ont été achetées chez Lonza et cultivées dans un milieu de croissance endothélial (EGM2-MV, Lonza). Les MEFs et les HDLECs ont été utilisés au passage 2 ou 3. Les cellules ont été incubées dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C et confirmées comme étant mycoplasmiques négatives (kit de détection MycoAlert, Lonza).

Essai de germination à base de sphéroïdes

Les sphéroïdes de HDLEC ont été générés en cultivant des HDLEC au passage 2 ou 3 dans un milieu de culture contenant 0,25 % de méthylcellulose et en les incubant pendant la nuit sous forme de gouttes suspendues36. Les sphéroïdes ont ensuite été collectés et inclus dans 2 mg/ml de collagène de type I (Corning), traités avec de l’albumine de sérum bovin (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) ou ANGPT2 (5 μg/ml, généré en interne) avec ou sans VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) dans du milieu de base pour cellules endothéliales (PromoCell) contenant 1% de FBS pendant 24 h. À la fin de l’incubation, les sphéroïdes ont été colorés avec du cell tracker (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 min). Les sphéroïdes ont ensuite été fixés dans du PFA à 4 % pendant 15 min à température ambiante et imagés à l’aide de Cell observer (Carl Zeiss).

RT-PCR quantitative

L’ARN a été extrait à l’aide du kit RNeasy Micro (Qiagen) ou du kit d’extraction d’ARN Trizol (Invitrogen). Un total de 1 µg d’ARN extrait a été transcrit en ADNc à l’aide du kit de transcription inverse GoScript (Promega). La PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant le mélange maître FastStart SYBR Green (Roche) et le thermocycleur S1000 (Bio-Rad) avec les amorces indiquées. Les amorces ont été conçues en utilisant Primer-BLAST ou adoptées à partir d’études publiées précédemment, qui sont décrites dans le tableau supplémentaire 1. La Gapdh a été utilisée comme gène de référence et les résultats ont été présentés sous forme d’expressions relatives au contrôle. La spécificité de la réaction des amorces a été confirmée par l’analyse de la courbe de fusion. L’expression relative des gènes a été analysée par la méthode ΔΔCt à l’aide du logiciel CFX Manager (Bio-Rad).

Expériences in vitro d’étirement et d’osmose

Les FME et les IntSC primaires de souris ont été étirés à l’aide d’un instrument mécanique d’étirement cellulaire (STREX) avec 4 % d’étirement linéaire à 10 cycles/min, et un stress osmotique a été appliqué avec du sorbitol 0,4 M pendant 3 h, comme décrit précédemment40,50. Les cellules ont été maintenues dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C pendant toutes les expériences.

Expériences osmotiques ex vivo

Après avoir ouvert la cavité abdominale sous anesthésie, la partie jéjunale de l’intestin grêle a été coupée en morceaux de 2 cm. Les fragments d’intestin ont été ouverts longitudinalement et lavés avec du PBS. Les tissus ont ensuite été cultivés dans du DMEM/F12 comprenant 5% de FBS et un stress osmotique a été appliqué immédiatement avec du sorbitol 0,4 M dans le milieu de culture pendant 3 h. Les tissus ont été maintenus dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 37 °C pendant toutes les expériences.

Coloration immunofluorescente des MEF

Les MEF ont été plaqués sur des lames de chambre Nunc Lab-Tek II à 8 puits (Sigma-Aldrich) et fixés avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min à 4 °C. Après plusieurs lavages avec du PBS, les échantillons ont été bloqués avec du sérum de chèvre (ou d’âne) à 5% dans du PBST à 0,5% pendant 30 minutes à température ambiante. Les cellules ont été incubées avec les anticorps primaires indiqués à 4 °C pendant la nuit. Les anticorps primaires liés ont été détectés par incubation avec des anticorps secondaires pendant 90 minutes à température ambiante. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés pour la coloration des cellules : anticorps anti-YAP (monoclonal de lapin, 14074, Cell signaling) ; anticorps anti-TAZ (polyclonal de lapin, HPA007415, Sigma-Aldrich) ; et anticorps anti-phalloïdine conjugué à Alexa Fluor 488 (A12379, Thermo Fisher). Les anticorps secondaires conjugués à l’Alexa Fluor 594 ont été achetés chez Jackson ImmunoResearch. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (Invitrogen) et les lames ont été montées et imagées comme décrit ci-dessus.

ChIP-qPCR

Les MEF ont été fixés avec du PFA à 1% pendant 10 min et éteints avec de la glycine. Les échantillons ont été lavés avec du PBS et lysés avec un tampon de lyse contenant 1% de SDS. L’ADN fixé dans les lysats cellulaires a été soniqué à l’aide d’un ultrasoniseur focalisé (Covaris). Les lysats cellulaires ont été centrifugés et tous les surnageants, sauf 5 % (conservés pour le contrôle d’entrée du lysat de cellules entières), ont été dilués avec un tampon de dilution ChIP contenant 0,5 % de Triton X-100. Les échantillons dilués ont ensuite été incubés pendant une nuit à 4 °C avec l’anticorps anti-TEAD4 (monoclonal de souris, ab58310, Abcam). Ensuite, des Dynabeads de protéine A/G (Thermo Fisher) ont été ajoutés et les échantillons ont été incubés pendant 2 h à 4 °C. Les billes ont été isolées avec DynaMag-2 (Thermo Fisher), lavées avec une série de tampons de lavage ChIP : tampon de lavage à faible teneur en sel, tampon de lavage à haute teneur en sel, tampon de lavage LiCl et tampon TE. Les échantillons ont été élués dans du SDS à 1 % deux fois pendant 15 minutes chacune à 65 °C. Les billes ont été retirées et le matériel élué ainsi que les échantillons d’entrée de lysat de cellules entières à 5 % ont été réticulés pendant la nuit à 65 °C. Après normalisation du pH, les échantillons ont été incubés pendant 30 min avec de la RNase (3 μg/ml) à 37 °C et pendant 2 h avec de la protéinase K (20 mg/ml) et du glycogène (20 mg/ml) à 55 °C. L’ADN a été élué en utilisant des procédures standard et les ChIP-ADN ont été analysés par qPCR par rapport aux échantillons d’entrée en utilisant les amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 2.

ELISA

Le surnageant des IntSC de souris en culture primaire a été récolté après étirement, et le surnageant a été centrifugé pendant 15 min. La concentration de VEGF-C dans le surnageant a été mesurée par dosage immuno-enzymatique (ELISA) avec le kit ELISA spécifique au VEGF-C de souris (CSB-E07361m, Cusabio).

Analyse morphométrique

Les mesures morphométriques ont été réalisées à l’aide des logiciels ImageJ (NIH), ZEN 2012 (Carl Zeiss) ou Imaris (Bitplane). Pour la quantification de la surface lactéale, un seuil a été défini pour les images à analyser et la surface absolue de la villosité LYVE-1+ a été mesurée pour chaque lactéale au sein de la villosité. La longueur absolue du lactus, la longueur absolue des villosités et la largeur absolue des villosités ont été mesurées en utilisant les images de l’immunomarquage des villosités E-cadhérine+ ou CD31+ ou LYVE-1+ dans chaque champ aléatoire de 850 µm2 de la partie indiquée de l’intestin. Pour les quantifications de la surface, de la longueur et de la largeur des lactaires et des villosités, au moins 100 villosités ont été analysées sur l’ensemble de l’intestin grêle. La quantification des paramètres suivants dans l’intestin grêle a été effectuée dans le jéjunum. Le nombre de germes lactéaux et le nombre de ramifications lactéales ont été mesurés dans 10 à 20 lactéaux LYVE-1+ choisis au hasard. Le nombre de LECs Prox1+ et le nombre de LECs Prox1+EdU+ ont été comptés manuellement dans une longueur de 100 μm de 10-20 lacteaux LYVE-1+ aléatoires. La quantification des jonctions VE-cadhérine+ du lactus a été réalisée avec un objectif ×40 dans les lactus de 5-10 villosités par souris. En bref, la jonction de type fermeture éclair a été définie comme des jonctions continues aux frontières cellule-cellule avec des cellules qui ont une forme allongée51. La jonction de type bouton a été définie comme des jonctions discontinues qui ne sont pas parallèles aux frontières cellule-cellule et la forme de cellule en feuille de chêne. Les jonctions qui ne correspondent à aucun des deux modèles ont été classées comme étant de type mixte. L’intensité de fluorescence (IF) du BODIPY et sa quantification ont été réalisées comme décrit précédemment34. La surface de l’Oil Red O a été mesurée comme la surface de l’Oil Red O+ divisée par la surface de la villosité et normalisée par la moyenne de celles des souris témoins. La surface de couverture des cellules musculaires lisses des villosités a été mesurée en tant que surface absolue de couverture αSMA+ dans cinq champs de 850 µm2 par échantillon, qui a ensuite été normalisée par la moyenne de celles des souris témoins. Pour quantifier les expressions relatives du VEGFR3 lactéal, l’IF moyen a été mesuré dans cinq champs de 425 µm2 par échantillons et a été présenté sous forme de valeurs relatives divisées par son contrôle. Pour déterminer la densité des vaisseaux sanguins, la surface du VEGFR2 a été mesurée dans cinq champs de 425 µm2 par échantillon et a été présentée en valeurs relatives par rapport à son contrôle. La surface des cellules T CD3+ ou des macrophages F4/80+ a été mesurée dans cinq champs de 425 µm2 par échantillon. La densité des vaisseaux lymphatiques a été calculée en mesurant la zone LYVE-1+ dans cinq champs aléatoires de 425-850 µm2 à partir d’échantillons de montage entier et présentée comme des valeurs relatives à son contrôle.

Séquençage de l’ARN unicellulaire basé sur les gouttelettes

Les cellules uniques triées ont été traitées à l’aide du kit de réactifs 10X Chromium Single cell 3′ v3 (10X genomics) en suivant les protocoles du fabricant. Brièvement, les cellules triées ont été remises en suspension dans du PBS avec 0,5 % de BSA et mélangées avec le mélange de réactifs RT et l’amorce RT, qui ont ensuite été ajoutés à chaque canal des puces 10X, en ciblant 5000 cellules. Les cellules ont été séparées dans des billes de gel en émulsion où les transcriptions d’ARN de cellules uniques ont été codées par code-barres et transcrites en sens inverse. Après la construction et l’amplification de la bibliothèque d’ADNc, les molécules d’ADNc ont été fragmentées par voie enzymatique, réparées au niveau des extrémités et mises en queue A. Après avoir sélectionné la taille appropriée des molécules d’ADNc traitées par double sélection de taille à l’aide de billes SPRI (Beckman Coulter), elles ont été ligaturées avec un adaptateur et une PCR d’indexation des échantillons a été réalisée. Après une autre double sélection de taille à l’aide de billes SPRI, les constructions de bibliothèques finales ont été diluées 10 fois et analysées sur la puce haute sensibilité Agilent Bioanalyzer pour le contrôle de qualité. Les bibliothèques unicellulaires ont ensuite été séquencées à l’aide de la plateforme Illumina HiSeq-X.

Pré-traitement des données d’ARN unicellulaires

Les données brutes de séquençage ont d’abord été démultiplexées et mappées sur le génome de référence de la souris (mm10) en utilisant la boîte à outils Cell Ranger 3.0.2 de 10X Genomics (http://10xgenomics.com). À l’aide du paquet R Seurat (version 3.0.0)52, les matrices d’expression brutes ont été construites en utilisant la fonction Read10X. Les cellules présentant moins de 1000 gènes détectés ou plus de 6000 gènes détectés (considérés comme des doublets potentiels) ont été exclues (figure supplémentaire 17a). En outre, les cellules présentant un nombre élevé d’identificateurs moléculaires uniques (UMI) associés aux gènes mitochondriaux (>7 % du total) ont été considérées comme des cellules mortes et donc exclues. Pour les gènes, ceux exprimés par moins de 3 cellules ont été supprimés. En outre, un petit nombre de cellules immunitaires Ptprc+ et de cellules endothéliales Pecam1+ Cdh5+ contaminantes ont été exclues après le premier tour de regroupement. Après avoir éliminé les cellules et les gènes indésirables, les comptes UMI pour chaque gène d’une cellule ont été divisés par l’expression totale d’une cellule donnée, puis multipliés par 10 000 et transformés en logarithme. Ensuite, les gènes ont été mis à l’échelle et centrés en régressant hors des variables telles que le pourcentage de gènes mitochondriaux et le nombre d’UMI.

Identification des gènes variables et réduction de la dimensionnalité

Le paquet R Seurat a été utilisé pour l’analyse de regroupement. Tout d’abord, les gènes hautement variables à travers l’ensemble de données ont été identifiés à l’aide de la fonction FindVariableFeatures de Seurat avec l’option : selection.method = « vst ». Les 2000 gènes présentant la plus grande variabilité ont été sélectionnés pour une analyse en aval. En utilisant les gènes variables identifiés, des réductions initiales de la dimensionnalité ont été effectuées en utilisant l’analyse en composantes principales (ACP). La fonction JackStraw a été utilisée pour déterminer la signification statistique des scores PCA. Les 30 composantes principales (PC) les plus significatives ont été utilisées comme entrée pour l’Approximation et la Projection Manifold Uniforme (UMAP) afin de réduire les données dans un espace bidimensionnel.

Analyse de cluster

Afin de regrouper les cellules par leurs profils transcriptionnels, nous avons effectué un clustering non supervisé sur les 2000 principaux gènes hautement variables pour les quatre échantillons. Nous avons d’abord construit un graphe de voisins les plus proches partagés (SNN) sur l’espace des composantes principales en utilisant la fonction FindNeighbors. Nous avons ensuite appliqué l’algorithme de Louvain pour un regroupement basé sur l’optimisation de la modularité en utilisant la fonction FindClusters. Les paramètres de résolution de la mise en grappes ont été fixés au point où les grappes présentaient des profils transcriptionnels très distincts. Les regroupements étaient indépendants du nombre de gènes détectés par cellule (figure supplémentaire 17b). Les marqueurs spécifiques aux clusters étaient des gènes exprimés de manière différentielle pour chaque cluster identifié par la fonction FindMarkers de Seurat avec les paramètres suivants : min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15,test.use = « MAST ». Les marqueurs identifiés avec P < 0,05 ajusté ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Puisque certains types cellulaires tels que les cellules musculaires lisses et les cellules murales avaient des marqueurs bien connus, leur apparition en tête de liste des marqueurs pour chaque cluster a validé nos processus de sélection des marqueurs. Pour éliminer les sources de variations indésirables telles que le sexe, les cellules ont été séparées par la présence du transcrit Xist spécifique aux femelles et intégrées. Pour effectuer l’intégration de différents ensembles de données, nous avons d’abord log-normalisé chaque matrice d’expression brute et identifié les 2000 gènes les plus variables pour chaque ensemble de données. Ensuite, en utilisant la fonction FindIntegrationAnchors de Seurat, nous avons identifié les ancres entre les ensembles de données. Ensuite, les ensembles de données ont été intégrés sur la base des ancres identifiées via la fonction IntegrateData de Seurat. Les ensembles de données intégrés ont ensuite été mis à l’échelle et les dimensions ont été réduites pour une analyse plus approfondie des clusters. Les clusters dans les ensembles de données intégrés ont été annotés par leurs profils d’expression des gènes dans les listes de faiseurs identifiés.

Analyse d’enrichissement de l’ontologie génétique

L’analyse d’enrichissement de l’ontologie génétique sur les marqueurs de clusters a été réalisée à l’aide du package R goseq (version 1.34.0)53. En fonction de la longueur du gène, des pondérations pour chaque gène ont été obtenues et l’approximation de Wallenius a été utilisée pour identifier les termes d’ontologie génétique associés. Les termes d’ontologie génique qui ont un P ajusté < 0,05 et les catégories de processus biologiques ont été sélectionnés.

Statistiques

Aucune méthode statistique n’a été utilisée pour prédéterminer la taille de l’échantillon. Les expériences ont été randomisées et les investigateurs étaient aveugles à l’allocation pendant les expériences et les analyses de résultats. Toutes les valeurs sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET). La signification statistique a été déterminée par le test U bilatéral de Mann-Whitney entre deux groupes ou par l’ANOVA à deux voies avec le test de comparaisons multiples de Holm-Sidak pour la comparaison entre plusieurs groupes. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.