1 Théorie
Les oligonucléotides sont synthétisés par l’ajout d’une base à la fois, s’étendant de l’extrémité 3′ à l’extrémité 5′, attachée à un support en phase solide. Lorsque la synthèse chimique de l’oligonucléotide est terminée, la chaîne d’ADN est libérée du support solide par incubation avec de l’hydroxyde d’ammonium. L’ammonium agit également comme un agent déprotecteur, en éliminant les groupes protégeant les phosphates dans les liaisons phosphodiester. Ensuite, de l’ammoniac chaud est ajouté pour hydrolyser les groupes protecteurs des groupes amino exocycliques de la désoxyadénosine, de la désoxycytosine et de la désoxyguanosine. L’oligonucléotide peut être fourni à l’utilisateur dans la solution d’ammoniac comme une préparation brute. Dans ce cas, avant utilisation, il peut être nécessaire de réaliser une étape supplémentaire pour éliminer les sels et les sous-produits de la préparation d’oligonucléotides générés lors de la déprotection.
Après déprotection, la préparation d’oligonucléotides est généralement dessalée, quantifiée, évaporée à sec dans un lyophilisateur, et fournie à l’utilisateur sous forme de poudre. La solution d’oligonucléotides dessalée contient l’oligonucléotide de pleine longueur mais aussi un mélange de produits tronqués qui se sont accumulés pendant la synthèse chimique. La troncature se produit lorsque la base spécifiée ne parvient pas à s’ajouter à la chaîne dans le cycle correspondant (Hecker & Rill, 1998). Ainsi, le pourcentage de produits tronqués accumulés dans la préparation est déterminé par l’efficacité de synthèse (la fraction de produit complet après synthèse) et la longueur de la molécule. Les oligonucléotides longs, dont la synthèse nécessite plus de cycles, sont moins purs que les oligonucléotides courts. Ces défaillances peuvent entrer en concurrence avec le produit de pleine longueur dans certaines applications et doivent être éliminées avant que l’oligonucléotide ne puisse être utilisé. Cependant, les préparations d’oligonucléotides dessalées conviennent généralement à de nombreuses applications, telles que la PCR standard ou les microarrays, en particulier si l’oligonucléotide a < 20 nucléotides de longueur.
Une purification supplémentaire pour les oligonucléotides de plus de 50 bases est recommandée car le pourcentage de produit de pleine longueur dans la préparation ne dépasse généralement pas 80 %. Pour les applications exigeantes où la longueur exacte de l’oligonucléotide est importante, telles que les essais de déplacement sur gel, la mutagenèse dirigée par site, le séquençage, la production d’adaptateurs de clonage ou la synthèse d’ADNc premier brin pour la génération de bibliothèques, une purification supplémentaire est recommandée, même pour les oligonucléotides plus courts (voir plus d’informations sur les techniques ci-dessus sur les essais standard in vitro pour les interactions protéine-acide nucléique – essais de déplacement sur gel pour la liaison ARN et ADN et la mutagenèse dirigée par site).
La purification peut être nécessaire après la synthèse ou après la modification enzymatique de l’oligonucléotide. Il existe plusieurs méthodes pour y parvenir, et le choix dépend de la nature de l’oligonucléotide et de l’application à laquelle il est destiné.
La purification par HPLC en phase inverse est basée sur l’hydrophobie. Elle utilise une phase stationnaire non polaire, et des tampons aqueux et des solvants organiques comme phase mobile pour éluer les analytes ; les composés polaires sont élués en premier, tandis que les composés non polaires sont retenus. C’est la meilleure méthode pour purifier les oligonucléotides modifiés avec un groupe hydrophobe, comme la biotine, les marqueurs de colorants fluorescents ou les conjugaisons NHS-ester. La récupération de masse est plus élevée que lors de la purification par PAGE et cette méthode se prête à la purification de plus grandes quantités d’oligonucléotides (échelle de la mmole), bien qu’elle n’élimine pas aussi efficacement les produits incomplets. Les cartouches de purification des oligonucléotides, basées sur la chromatographie en phase inverse, constituent une méthode rapide de dessalage et de purification des oligonucléotides.
L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) résout les oligonucléotides en fonction de leur longueur et offre ainsi une résolution suffisante pour différencier les produits complets des molécules ratées (Atkinson et Smith, 1984). Les gels de polyacrylamide sont plus efficaces pour séparer les petits fragments d’ADN que les gels d’agarose (voir Analyse de l’ARN par électrophorèse analytique sur gel de polyacrylamide et Electrophorèse sur gel d’agarose). Le seul inconvénient des gels de polyacrylamide est qu’ils sont plus difficiles à préparer et à manipuler que les gels d’agarose. Les gels de polyacrylamide sont passés en configuration verticale dans un champ électrique constant. Après l’électrophorèse, l’oligonucléotide est élué du gel et concentré, par précipitation à l’éthanol (pour en savoir plus sur la précipitation des acides nucléiques, voir Purification de l’ARN – Méthodes de précipitation) ou par chromatographie en phase inverse. C’est la méthode de choix lorsqu’on souhaite obtenir le plus haut pourcentage d’oligonucléotides complets pour des applications exigeantes. Elle est également fortement recommandée pour les oligonucléotides de plus de 30 bases. En outre, plusieurs échantillons peuvent être analysés simultanément et aucun équipement coûteux n’est nécessaire. Le seul inconvénient de cette technique est la faible quantité d’oligonucléotide obtenue par purification. Généralement, les oligonucléotides sont utilisés à l’échelle de 1 μmol ou moins, et la récupération de masse après purification par PAGE est < 50% et encore plus faible dans le cas d’oligonucléotides modifiés. Néanmoins, bien que le rendement soit faible, il est satisfaisant pour la plupart des applications biochimiques.
La préparation d’oligonucléotides est chargée sur un gel de polyacrylamide dénaturant à une quantité d’au moins 1 mg par voie. La gamme de résolution du gel dépend de la concentration de polyacrylamide. Pour les oligonucléotides courts (de 15 à 35 bases), des gels de polyacrylamide à 13-15% sont recommandés ; pour les oligonucléotides plus longs (de 35 à 70 bases), des gels de polyacrylamide à 8-13% sont recommandés. Le pourcentage du gel doit être adapté au système d’exécution. Nous utilisons habituellement le système Mini Protean II de Bio-Rad et exécutons des gels à 15% pour purifier des oligonucléotides de 25 bases de long. Après identification de la bonne bande par visualisation UV, la bande est excisée et extraite du gel.
Deux méthodes différentes de purification des oligonucléotides à partir des gels de polyacrylamide sont décrites dans ce chapitre. La méthode la plus simple est l’élution par diffusion. Elle est basée sur le mouvement des molécules d’une région de plus forte concentration vers une région de plus faible concentration. Le résultat de la diffusion est un mélange progressif du matériau. Cette méthode prend du temps, mais elle ne nécessite pas trop de travail ni d’équipement. En gros, la bande de polyacrylamide contenant l’oligonucléotide d’intérêt est découpée en petits morceaux et recouverte de tampon d’élution. Après incubation, l’ADN est purifié du surnageant par précipitation à l’éthanol. Le rendement est limité, entre 20% et 70%, selon la longueur de l’oligonucléotide. Plus la quantité de tampon d’élution utilisée est importante, plus l’oligonucléotide est diffusé à partir du gel.
La deuxième méthode est l’électroélution dans un sac de dialyse (McDonell et al., 1977). Le morceau de gel contenant l’oligonucléotide est excisé et placé dans un sac de dialyse avec un tampon. L’application d’un courant électrique fait migrer l’ADN du gel vers le tampon du sac de dialyse. L’oligonucléotide est récupéré de ce tampon et purifié. Cette méthode permet d’isoler l’oligonucléotide avec un bon rendement, bien qu’elle prenne du temps si un grand nombre d’échantillons sont purifiés en même temps, car elle nécessite l’insertion de chaque bande de gel dans des sacs de dialyse individuels. Cette méthode fonctionne également bien pour les fragments d’ADN plus grands et peut même être utilisée pour extraire l’ADN des gels d’agarose.