Distinct fibroblast subsets regulate lacteal integrity through YAP/TAZ-induced VEGF-C in intestinal villi

Kísérleti állatok

Az állatok gondozása és a kísérleti eljárások megfeleltek az összes etikai előírásoknak az állatkísérletek és kísérletek során, az intézményi állatgondozási és felhasználási bizottság jóváhagyásával (No. KA2016-12) jóváhagyásával történt. A Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 és Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 egereket a KAIST specifikus patogénmentes (SPF) állattartó létesítményeiben helyezték át, hozták létre és tenyésztették. A C57BL/6 J, R26-tdTomato és Myh11-Cre-ERT2 egereket a Jackson Laboratory-tól vásárolták. Valamennyi egeret C57BL/6 háttérrel tartották, és szabad hozzáférést biztosítottak standard étrendhez (PMI LabDiet) és vízhez. A Cre-ERT2 egerek Cre-aktivitásának kiváltása érdekében 2 mg kukoricaolajban (Sigma-Aldrich) oldott tamoxifent (Sigma-Aldrich) adtunk be intraperitoneálisan (i.p.) az egyes kísérletek jelzett időpontjában. A Cre-ERT2 negatív, de flox/flox-pozitív egereket az alomtestvérek közül minden kísérletben kontroll (WT) egereknek tekintettük. Az egereket altatószerek kombinációjának (80 mg/kg ketamin és 12 mg/kg xilazin) i.p. injekciójával altattuk, mielőtt feláldoztuk őket.

Hisztológiai elemzések

A vékonybél egészalakos festéséhez az altatást követően 2%-os paraformaldehiddel (PFA) transzkardiális perfúziót végeztünk. A vékonybelet kitermeltük és hosszanti irányban felvágtuk, hogy feltárjuk a lument. Többszöri PBS-sel történő mosás után a beleket szilikonlemezekre tűztük. A mintákat ezután 4 °C-on 4%-os PFA-ban 2 órán át posztfixáltuk. A mintákat többször mostuk PBS-szel, majd 10%-os szacharózzal PBS-ben 2 órán át, illetve 20%-os szacharózzal, 10%-os glicerinnel PBS-ben egy éjszakán át dehidratáltuk. A fülbőrt, a légcsövet és a rekeszizmot transzkardiális perfúzió nélkül vettük le, és 4 °C-on 1 órán át 4%-os PFA-ban rögzítettük. A mintákat blokkolás előtt többször mostuk PBS-szel. Miután 1 órán át 5%-os kecske- vagy szamárszérummal blokkoltuk 0,5%-os Triton-X 100-ban PBS-ben (PBST), a mintákat a blokkoló oldatban hígított, jelzett primer antitestekkel inkubáltuk 4 °C-on egy éjszakán át. Többszöri PBST-vel történő mosás után a mintákat 2 órán át szobahőmérsékleten (RT) inkubáltuk a blokkoló pufferben hígított, jelzett fluorokróm-konjugált másodlagos antitestekkel. A mintákat PBST-vel mostuk, majd a sejtmagokat DAPI-val (Invitrogen) festettük. PBS-sel történő mosás után a mintákat Vecta-shield (Vector Laboratories) segítségével montíroztuk. A képeket Zeiss LSM 800 vagy LSM 880 konfokális mikroszkóppal (Carl Zeiss) készítettük.

Az immunfestéshez a következő elsődleges és másodlagos antitesteket használtuk: anti-LYVE-1 (nyúl poliklonális, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (patkány monoklonális, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (hörcsög monoklonális, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-kadherin (kecske poliklonális, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (kecske poliklonális, AF2727, R&D, 1:400); anti-Prox1 (nyúl poliklonális, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anti-VE-kadherin (kecske poliklonális, AF1002, R&D, 1:200); anti-PDGFRβ (patkány monoklonális, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (egér monoklonális, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (kecske poliklonális, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (nyúl monoklonális, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (nyúl poliklonális, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (nyúl poliklonális, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (nyúl poliklonális, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (kecske poliklonális, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (nyúl poliklonális, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (kecske poliklonális, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (nyúl monoklonális, 14074, Cell signaling, 1:200); anti-TAZ (nyúl poliklonális, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-αSMA, fluoreszcein-izotiocianát (FITC)-konjugált (egér monoklonális, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (kecske poliklonális, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (kecske poliklonális, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (nyúl monoklonális, 13179, Cell signaling, 1:400); anti-F4/80, FITC-konjugált (patkány monoklonális, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (hörcsög monoklonális, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmin (nyúl poliklonális, AB907, Millipore, 1:400); és az Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-konjugált nyúl-, patkány-, kecske-, hörcsög-ellenes másodlagos antitesteket (1:1000 arányban hígítva) a Jackson ImmunoResearch-től vásároltuk. A vizsgálatunkban használt összes antitestet validáltuk a fajra és az alkalmazásra.

Egymolekulás fluoreszcens in situ hibridizáció (smFISH)

A vékonybél smFISH-hez érzéstelenítés után 2%-os PFA-val transzkardiális perfúziót végeztünk. A mintákat 4 °C-on 4%-os PFA-ban 2 órán keresztül posztfixáltuk. A mintákat többször mostuk PBS-szel, 30%-os szacharózba helyeztük, és egy éjszakán át inkubáltuk. Az OCT-be ágyazott mintákat metszettük, és az smFISH-t a gyártó RNAscope Fluorescent Multiplex Assay kitben (320850, ACDBio) leírt protokoll szerint végeztük el. Az smFISH-hez az RNScope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) szondát használtuk. Az alábbi elsődleges és másodlagos antitesteket használtuk az smFISH immunfestéshez: anti-PDGFRβ (patkány monoklonális, ab91066, Abcam); anti-Shisa3 (nyúl poliklonális, TA320118, Origene); anti-P2X1 (nyúl poliklonális, APR-001, Alomone labs) és Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-konjugált másodlagos antitesteket a Jackson ImmunoResearch-től vásároltuk. A képeket Zeiss LSM 800 vagy LSM 880 konfokális mikroszkóppal (Carl Zeiss) készítettük.

EdU beépülési próba a proliferáló LEC-ek kimutatására

A proliferáló LEC-ek kimutatásához a tejmirigyben 5 mg 5-etinil-2′-deoxyuridint (EdU, A10044, Invitrogen) oldottunk fel 1 ml Milli-Q vízben törzsoldatként. Ezután egerenként 200 μl törzsoldatot fecskendeztünk be i.p. minden második napon egy héten keresztül az elemzés előtt. A vékonybelet a fent leírtak szerint izoláltuk és dolgoztuk fel. Az EdU-korporált sejteket a Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) segítségével detektáltuk a gyártó protokollja szerint.

Elektronmikroszkópia

A tejmirigyek ultrastruktúrájáról készült elektronmikroszkópos képek készítéséhez a vékonybelet 4%-os PFA-val és 0,25%-os glutaraldehiddel 0,1 M foszfátpufferben (pH 7,4) végzett transzkardiális perfúzió után metszettük. A mintákat ezután egy éjszakán át 2,5%-os glutaraldehidben fixáltuk, majd 1%-os ozmiumtetroxiddal utófixáltuk, és növekvő etanolkoncentrációjú sorozatban dehidratáltuk, majd gyantába ágyaztuk. Ultramikrotómmal (UltraCut-UCT, Leica) 70 nm-es ultravékony laktátmetszeteket készítettünk, amelyeket aztán rézrácsra gyűjtöttünk. A mintákat transzmissziós EM (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) segítségével 120 kV-on képeztük le, miután 2%-os uranil-acetáttal és ólom-citráttal festettük őket.

A lamina propria lipidek kiürülésének intravitális képalkotása

Az egereket a táplálék eltávolítása után 12 órával az eljárás előtt elaltattuk. Az intravitalis képalkotást a korábban leírtak szerint végeztük34. Röviden, a BODIPY lipidszondákat (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) 2,5%-os DMSO-oldatban (Sigma-Aldrich) oldottuk fel. Anti-LYVE-1 (patkány monoklonális, 223322, R&D) Alexa Fluor 647 (Invitrogen) antitesttel konjugált (0,75 mg/kg) antitestet intravénásan adtunk be 12 órával a képalkotás előtt a tejnedvek fluoreszcens jelöléséhez. Ezután a proximális jejunumot egy képalkotó kamrába helyeztük, ahol a képalkotás során a hőmérsékletet 37 °C-on tartottuk. A bél lumenének 1,5 cm-es sebészi megnyitása után az anti-mesenterikus határ mentén fedőüveget helyeztünk a feltárt lumenre, hogy a bélbolyhokat láthassuk. Az intravitalis képalkotást három ülésen keresztül végeztük. A bélbolyhokat először a BODIPY-FA adagolása előtt, 0 percben képeztük le. Ezután a második képalkotó ülés előtt egyszer 30 μl BODIPY-lipidszondát juttattunk be, hogy megfigyeljük a kezdeti BODIPY-lipidfelszívódást 1 percnél. Ezután a BODIPY-lipideket háromszor, 2 perces időközönként adagoltuk a harmadik képalkotó ülés előtt, 26 perc múlva, és a BODIPY-FA tejcsatornákon keresztül történő kiürülését 36 perc és 46 perc múlva elemeztük. Egy házilag épített videorátos lézerpásztázó konfokális mikroszkópot használtunk34. A fluoreszcens képalkotáshoz két 488 nm-es (MLD, Coherent) és 640 nm-es (Cube, Coherent) folyamatos hullámú lézert használtunk gerjesztő forrásként. A fluoreszcens jelek detektálásához két sávszűrőt (FF01-525/50 és FF01-685/40, Semrock) használtunk. A 4 μm alatti axiális felbontást 100 μm-es tűlyukkal és 60x objektívvel (LUMFLN, vízimersziós, NA 1,1, Olympus) vettük fel. A képeket (512 × 512 pixel) 30 Hz-es képkockasebességgel készítettük. A kép jel-zaj arányának javítása érdekében a valós idejű képek (30 képkocka/mp) utófeldolgozását követő 90 képkocka zaját átlagoltuk, eltávolítva a perisztaltika által generált mozgásartifaktumot egy saját fejlesztésű MATLAB programmal. A lamina propria átlagos fluoreszcens intenzitásának mérésére az ImageJ szoftvert (NIH) használtuk.

Lipidfelszívódási vizsgálat

A 12 órás táplálékelvonást követően 200 μl olívaolajat (Sigma-Aldrich) adtunk be orális fecskendővel a plazma trigliceridszintjének méréséhez és Oil Red O festéshez. Az olívaolaj beadása után 0, 1, 2, 3 és 4 órával a farokvénán keresztül vért vettünk a heparint tartalmazó vérvételi csőbe. A plazma trigliceridkoncentrációját VetTest Chemistry analizátorral (IDEXX Lab) mértük. A vékonybelet olajvörös O-val festettük meg 12 órával az olívaolaj beadását követően az olajvörös O festő készlet (MAK194, Sigma-Aldrich) gyártójának protokollja szerint. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) (60% kcal zsír, Research Diets, D12492) etetése 12 hetes korban kezdődött, és 8 hétig folytatódott a plazma triglicerid mérése és az Oil Red O festés céljából. A vért 6 órás koplalás után a farokvénán keresztül vettük a heparint tartalmazó vérvételi csőbe. A májmetszetek Olajvörös O festéséhez a májat leszedtük, 4%-os PFA-ban egy éjszakán át 4 °C-on fixáltuk, 100 μm-es vibratóm metszetekre vágtuk (Leica, VT1200S), és Olajvörös O-val festettük.

AAV-transzdukció

Az indikált egerek egyszeri i.p. dózist (1012 vírusrészecske 150-200 µl-ben) a VEGFR3 ligandkötő doménjeit 1-4 kódoló rekombináns AAV-ból, amely az IgG Fc-doménhez fuzionált (AAV-mVEGFR31-4-Ig), míg a kontroll egerek ugyanilyen dózist kaptak a VEGFR3 VEGF-C-t vagy VEGF-D-t nem kötő doménjeit 4-7 kódoló AAV-ból (AAV-mVEGFR34-7-Ig), amely az IgG Fc-doménhez fuzionált, a korábban leírtak szerint37. Az AAV-mVEGFR31-4-Ig és az AAV-mVEGFR34-7-Ig szérumban immunoblotting elemzéssel (anti-VEGFR3 antitest; kecske poliklonális, AF743, R&D) 0.5 μl szérummintákból, amelyeket a bélvizsgálat napján gyűjtöttünk.

Az antitest kezelése

A VEGFR2 blokkolásához VEGFR2-neutralizáló antitestet (DC101) használtunk. A DC101-et termelő hibridóma-sejtvonalat az American Type Culture Collection (ATCC) cégtől vásároltuk. A hibridóma sejteket szérummentes tápfolyadékban tenyésztettük. A felülúszóban lévő rekombináns fehérjéket Protein A agarózgél (Oncogene) oszlopkromatográfiával tisztítottuk. A tisztítás után a rekombináns fehérjéket a Bradford-teszt segítségével számszerűsítettük, és a nátrium-dodecil-szulfát (SDS)-poliakrilamid gélelektroforézist (PAGE) követően Coomassie-kék festéssel igazoltuk. A DC101-et (50 mg/kg) vagy azonos mennyiségű kontroll antitestet (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) i.p. injekcióban adtuk be a jelzett egereknek 2 naponként 2 héten keresztül.

Bélrendszeri LEC dúsítás és IntSC izolálás a vékonybélből

A vékonybélből eltávolítottuk a serosát, az izomréteget és a mesenteriális zsírszöveteket. A béldarabok hosszanti felnyitása és PBS-szel való mosás után a mintákat 2 cm-es darabokra vágtuk, és eltávolítottuk a Peyer-foltokat. A mintákat PBS-szel mostuk és 10 mM EDTA-val, kalcium- és magnéziummentes DMEM-mel (Gibco) inkubáltuk 20 percig jégen. A szöveteket kalciummentes PBS-szel vortexeltük, amíg tiszta, hámsejtektől mentes felülúszót nem kaptunk. A mintadarabokat tovább vágtuk 1 mm-es darabokra, és 2 mg/ml kollagenáz II-t (Worthington), 1 mg/ml diszpázt (Gibco) és 1 U/ml DNázt (Invitrogen) tartalmazó disszociációs pufferrel disszociáltuk DMEM-ben 37 °C-on 30 percig. A disszociáció elősegítése érdekében a szövetdarabokat 10 percenként óvatosan fel-le pipettáztuk. A mintákat ezután 70 μm-es szűrőn keresztül szűrtük, hogy mechanikusan szétválasszuk a megmaradt béltöredékeket. A felülúszók összegyűjtése után azonos mennyiségű, 10% magzati szarvasmarha szérumot (FBS) tartalmazó DMEM-et adtunk hozzá. Centrifugálás után a sejteket PBS-ben reszuszpendáltuk. A stromasejt-frakció és a LEC-ek dúsításához a vérképző sejteket és a hámsejteket AutoMACS (Miltenyi) segítségével távolítottuk el, miután 15 percig jégen inkubáltuk anti-CD45 és anti-CD326 mikrogyöngyökkel (Miltenyi). Az IntSC izolálásához az anti-CD45 és anti-CD326 mikrogyöngyök mellett anti-CD31 mikrogyöngyöket (Miltenyi) adtunk az endothelsejtek eltávolításához.

Egerek IntSC-k elsődleges tenyésztése

Az IntSC-k izolálását követően a sejteket 10% FBS-t tartalmazó DMEM/F12-ben tenyésztettük szövettenyésztő lemezen 24 órán vagy 2 napon keresztül. A gyógyszeres kezelésekhez és az immunfluoreszcens festéshez lyukanként 50 000 sejtet ültettünk 4 lyukú Nunc Lab-Tek II kamrás tárgylemezekre (Sigma-Aldrich). A gyógyszer-koncentrációkat a feltüntetett ábraleírások ismertetik, az immunfluoreszcencia- és génexpressziós elemzéshez a kezelések 6 órán át tartottak. Az IntSC-k tenyésztéséhez lágy (1,5 kPa) és merev (28 kPa) mátrixokon egy 35 mm-es, elasztikusan alátámasztott felületű képalkotó tálat (Ibidi) használtunk 24 órán keresztül. A cre aktivitás indukálásához a WT vagy Yap/Tazi∆FRC egerekből származó primer tenyésztett IntSC-kben a sejteket 5 µM 4-hidroxi-tamoxifen (4-OHT) 100%-os etanolban (EtOH) vagy csak 100%-os EtOH-val kezeltük 2 napig kontrollként. A kísérletekhez a PDGFRβ+-ként validált IntSC-k tenyésztett-expanziós monorétegét használtuk.

Flow-citometria és sejtválogatás

A PDGFRβ+ IntSC-k vagy bélrendszeri LEC-k kiválogatásához a feldúsított frakciókat ACK lízispufferben (Gibco) 5 percig RT-n szuszpendálva RBC-lízisre küldtük. Az Fcγ receptorok egér anti-CD16/CD32-vel (553141, BD Bioscience) történő blokkolása után a sejteket 15 percig inkubáltuk a jelzett antitestekkel FACS pufferben (2% FBS PBS-ben). Többszöri mosás után a sejteket FACS Canto II (BD Biosciences) segítségével elemeztük, majd a kapott adatokat FlowJo szoftver (Treestar) segítségével tovább értékeltük. A sejtválogatást FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson) segítségével végeztük. Az elhalt sejteket DAPI (Sigma-Aldrich) festéssel zártuk ki, és a sejtdublettákat szisztematikusan kizártuk. A fluoreszcencia intenzitását tetszőleges egységekben, logaritmikus skálán fejezzük ki, az előremenő és oldalsó szórást pedig lineáris skálán ábrázoljuk. Az áramlási citometriához a következő antitesteket használtuk: FITC anti-egér CD45 (11-0451-85, patkány monoklonális, Biolegend); FITC anti-egér TER-119 (11-5921-85, patkány monoklonális, Biolegend); APC anti-egér CD31 (551262, patkány monoklonális, BD Bioscience); és PE/Cy7 anti-egér Podoplanin (127412, szíriai hörcsög monoklonális, Biolegend).

Bulk RNS-szekvenálás

Az izolált PDGFRβ+ IntSC-k tömeges RNS-szekvenálását az illesztési fájl megszerzésével végeztük el. Röviden, a leolvasásokat a TopHat szoftvereszköz segítségével térképeztük le. Az illesztési fájlt a transzkriptek összeállítására, gyakoriságuk becslésére és a gének vagy izoformák differenciális expressziójának kimutatására használtuk a mandzsetták segítségével. Az Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) eszközt használtuk az adatok további értékelésére a kanonikus jelátvitel kontextusában, és annak meghatározására, hogy a YAP/TAZ-hiperaktivált gének specifikusan kapcsolódnak-e a szekréciós molekulákhoz. A kanonikus jelátvitel szignifikanciáját a Benjamini-Hochberg-eljárással vizsgáltuk, amely a P-értéket a többszörös összehasonlítások korrigálására módosítja, és aktiválásukat vagy gátlásukat az aktivációs z-pontszámok alapján határoztuk meg. A klaszterelemzés és a heatmaps a Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/) segítségével készültek. A GSEA-hoz a Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/) génkészletgyűjteményeit használtuk.

MEF-ek és HDLEC-ek

Az egér embrionális fibroblasztokat (MEF-ek) E12,5 embriókból izoláltuk a korábban leírtak szerint32. Röviden, a fej-, végtag- és szívszöveteket eltávolítottuk, és a mintákat ollóval felaprítottuk, majd 0,1%-os tripszin/EDTA-val és DNázzal (1 U/ml, Invitrogen) 37 °C-on 20 percig emésztettük. Az emésztés és a meg nem emésztett szövetek eltávolítása után a sejteket rövid ideig pörgettük, 10 cm-es tányérra ültettük, és hagytuk, hogy szubkonfluenciáig növekedjenek. A MEF-eket ezután 10% FBS-t tartalmazó DMEM/F12-ben tartottuk. A humán dermális nyirokcsomó endotélsejteket (HDLEC) a Lonzától vásároltuk, és endotél növekedési táptalajban (EGM2-MV, Lonza) tenyésztettük. A MEF-eket és a HDLEC-eket 2. vagy 3. passzázsban használtuk. A sejteket 37 °C-on, 5% CO2-t tartalmazó, párásított atmoszférában inkubáltuk, és megerősítettük, hogy mikoplazma-negatívak (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Szferoid alapú csírázási próba

LEC szferoidokat hoztunk létre úgy, hogy a HDLEC-eket 2. vagy 3. passzázsban 0,25% metilcellulózt tartalmazó táptalajban tenyésztettük, és egy éjszakán át lógó cseppként36 inkubáltuk. A szferoidokat ezután összegyűjtöttük és 2 mg/ml I. típusú kollagénbe (Corning) ágyaztuk, majd kontroll szarvasmarha szérum albumin (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) vagy ANGPT2 (5 μg/ml, házon belül előállított) VEGF-C-vel (200 ng/ml, R&D Systems) vagy anélkül, 1% FBS-t tartalmazó Endothelial Cell Basal Mediumban (PromoCell) 24 órán keresztül. Az inkubáció végén a szferoidot sejtkövetővel (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 perc) festettük meg. Ezután a szferoidokat 4%-os PFA-ban rögzítettük 15 percig RT-n, majd Cell observer (Carl Zeiss) segítségével képet készítettünk róluk.

Kvantitatív RT-PCR

Az RNeasy Micro kit (Qiagen) vagy Trizol RNS extrakciós kit (Invitrogen) segítségével extraháltuk az RNS-t. Összesen 1 µg extrahált RNS-t a GoScript Reverse Transcription Kit (Promega) segítségével cDNS-vé írtunk át. A kvantitatív valós idejű PCR-t FastStart SYBR Green Master mix (Roche) és S1000 Thermocycler (Bio-Rad) segítségével végeztük a jelzett primerekkel. A primereket a Primer-BLAST segítségével terveztük, vagy korábban publikált tanulmányokból vettük át, amelyeket az 1. kiegészítő táblázatban ismertetünk. Referencia génként a Gapdh-t használtuk, és az eredményeket a kontrollhoz viszonyított relatív expresszióként mutattuk be. A primerreakció specifitását olvadási görbeelemzéssel igazoltuk. A relatív génexpressziót ΔΔCt módszerrel elemeztük a CFX Manager szoftver (Bio-Rad) segítségével.

In vitro nyújtási és ozmotikus kísérletek

MEF-eket és primer egér IntSC-ket mechanikus sejtnyújtó műszerrel (STREX) nyújtottunk 4%-os lineáris nyújtással 10 ciklus/perc sebességgel, és ozmotikus stresszt alkalmaztunk 0,4 M szorbittal 3 órán keresztül a korábban leírtak szerint40,50 . A sejteket minden kísérlet során 37 °C-on, 5%-os CO2 -os párásított inkubátorban tartottuk.

Ex vivo ozmotikus kísérletek

A hasüreg altatásban történő megnyitása után a vékonybél jejunum részét 2 cm-es darabokra vágtuk. A béldarabokat hosszanti irányban felnyitottuk és PBS-szel mostuk. A szöveteket ezután 5% FBS-t tartalmazó DMEM/F12-ben tenyésztettük, majd azonnal ozmotikus stresszt alkalmaztunk 0,4 M szorbitollal a táptalajban 3 órán keresztül. A szöveteket minden kísérlet során 37 °C-on, 5% CO2 -os párásított inkubátorban tartottuk.

MEF-ek immunfluoreszcens festése

A MEF-eket 8 lyukú Nunc Lab-Tek II kamrás tárgylemezekre (Sigma-Aldrich) ültettük, majd 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk 15 percig 4 °C-on. Többszöri PBS-sel történő mosás után a mintákat 5%-os kecske (vagy szamár) szérummal blokkoltuk 0,5%-os PBST-ben 30 percig RT-nél. A sejteket a jelzett primer antitestekkel inkubáltuk 4 °C-on egy éjszakán át. A kötött primer antitesteket másodlagos antitestekkel történő 90 perces RT-n történő inkubálással mutattuk ki. A sejtfestéshez a következő primer antitesteket használtuk: anti-YAP (nyúl monoklonális, 14074, Cell signaling); anti-TAZ (nyúl poliklonális, HPA007415, Sigma-Aldrich); és Alexa Fluor 488 konjugált anti-falloidin (A12379, Thermo Fisher) antitestek. Az Alexa Fluor 594 konjugált másodlagos antitesteket a Jackson ImmunoResearch-től vásároltuk. A sejtmagokat DAPI-val (Invitrogen) festettük, a tárgylemezeket a fent leírtak szerint montíroztuk és képeztük le.

ChIP-qPCR

A MEF-eket 1%-os PFA-val fixáltuk 10 percig, majd glicinnel kioltottuk. A mintákat PBS-szel mostuk és 1% SDS-t tartalmazó lízispufferrel lizáltuk. A sejtlizátumokban lévő rögzített DNS-t Focused-ultrahangosító (Covaris) segítségével szonikáztuk. A sejtlizátumokat centrifugáltuk, és az így kapott felülúszók 5%-a kivételével (amelyet a teljes sejtlizátum bemeneti kontrollhoz tartogattunk) 0,5% Triton X-100-at tartalmazó ChIP hígító pufferrel hígítottuk. A hígított mintákat ezután egy éjszakán át 4 °C-on anti-TEAD4 antitesttel (egér monoklonális, ab58310, Abcam) inkubáltuk. Ezután protein A/G Dynabeads-et (Thermo Fisher) adtunk hozzá, és a mintákat 2 órán át inkubáltuk 4 °C-on. A gyöngyöket DynaMag-2 (Thermo Fisher) segítségével izoláltuk, majd ChIP mosópufferek sorozatával mostuk: alacsony sótartalmú mosópuffer, magas sótartalmú mosópuffer, LiCl mosópuffer és TE puffer. A mintákat 1%-os SDS-ben két alkalommal, egyenként 15 percig 65 °C-on eluáltuk. A gyöngyöket eltávolítottuk, és mind az eluált anyagot, mind az 5%-os teljes sejtlízis bemeneti mintákat egy éjszakán át 65 °C-on reverz-kereszthivatkoztattuk. A pH normalizálása után a mintákat 30 percig inkubáltuk RNázzal (3 μg/ml) 37 °C-on, majd 2 órán át proteináz K-val (20 mg/ml) és glikogénnel (20 mg/ml) 55 °C-on. A DNS-t standard eljárásokkal eluáltuk, és a ChIP-DNS-t qPCR segítségével elemeztük a bemeneti mintákhoz képest a 2. kiegészítő táblázatban felsorolt primerek használatával.

ELISA

A primer tenyésztett egér IntSC-k felülúszóját nyújtás után szedtük le, és a felülúszót 15 percig centrifugáltuk. A VEGF-C koncentrációját a felülúszóban enzimhez kötött immunszorbiens teszttel (ELISA) mértük egér VEGF-C-specifikus ELISA kit (CSB-E07361m, Cusabio) segítségével.

Morfometriai elemzés

A morfometriai méréseket ImageJ szoftver (NIH), ZEN 2012 szoftver (Carl Zeiss) vagy Imaris (Bitplane) segítségével végeztük. A tejmirigyek felületének számszerűsítéséhez küszöbértéket állítottunk be az elemzendő képekhez, és az abszolút villus LYVE-1+ területet mértük a villuson belüli minden egyes tejmirigyre. Az abszolút tejbélhossz, az abszolút cimpahossz és az abszolút cimpaszélesség mérése a villus E-cadherin+ vagy CD31+ vagy LYVE-1+ immunfestés képeinek felhasználásával történt a bél jelzett részének minden egyes 850 µm2 -es véletlenszerű mezőjében. A tejbél és a villi felszínének, hosszának és szélességének számszerűsítéséhez legalább 100 villi-t elemeztünk a teljes vékonybél mentén. A vékonybélben a következő paraméterek mennyiségi meghatározását a jejunumban végeztük. A tejcsírák számát és a tejcsírák elágazásainak számát 10-20 véletlenszerű LYVE-1+ tejcsírán mértük. A Prox1+ LEC-ek számát és a Prox1+EdU+ LEC-ek számát kézzel számoltuk meg 10-20 véletlenszerű LYVE-1+ laktájon belül 100 μm hosszban. A tejcsatorna VE-kadherin+ kapcsolódási pontjainak számszerűsítését ×40 objektív lencsével végeztük a tejcsatornákban, egérenként 5-10 villiben. Röviden, a cipzár típusú csomópontot úgy definiáltuk, mint folyamatos csomópontokat a sejt-sejt határoknál, olyan sejtekkel, amelyek megnyúlt alakúak51. A gombszerű csomópontot a sejt-sejt határokkal nem párhuzamos és a tölgyfalevél-szerű sejtformával párhuzamos, diszkontinuus csomópontként definiáltuk. Azokat a csomópontokat, amelyek egyik mintának sem felelnek meg, vegyes típusba soroltuk. A BODIPY fluoreszcencia-intenzitását (FI) és annak mennyiségi meghatározását a korábban leírtak szerint végeztük34. Az Olajvörös O területet az Olajvörös O+ terület és a villus területének hányadosaként mértük, és a kontroll egerek területének átlagával normalizáltuk. A villus simaizomsejtekkel borított területét mint abszolút αSMA+ borított területet mértük mintánként öt 850 µm2 -es mezőben, amelyet aztán a kontroll egerekéinek átlagával normalizáltunk. A tejmirigy VEGFR3 relatív expressziójának számszerűsítéséhez az átlagos FI-t mintánként öt 425 µm2 -es mezőben mértük, és a relatív értékeket a kontroll értékével elosztva mutattuk be. Az érsűrűség meghatározásához a VEGFR2 területét mintánként öt 425 µm2 -es mezőben mértük, és a kontrollhoz viszonyított relatív értékként mutattuk be. A CD3+ T-sejtek vagy F4/80+ makrofágok területét mintánként öt 425 µm2 -es mezőben mértük. A nyirokerek sűrűségét a LYVE-1+ területének mérésével számoltuk ki a teljes mount minták öt véletlenszerű 425-850 µm2 -es mezőjében, és a kontrollhoz viszonyított relatív értékként mutattuk be.

Csepp alapú egysejtes RNS-szekvenálás

A válogatott egysejteket a 10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) segítségével dolgoztuk fel a gyártó protokollja szerint. Röviden, a szortírozott sejteket 0,5% BSA-t tartalmazó PBS-ben reszuszpendáltuk, majd RT reagenskeverékkel és RT primerrel kevertük, amelyet ezután a 10X chipek minden egyes csatornájába adtunk, 5000 sejtet megcélozva. A sejteket emulziós gélgyöngyökbe szeparáltuk, ahol az egyes sejtekből származó RNS-átiratokat vonalkódoltuk és reverz transzkriptáltuk. A cDNS-könyvtár építése és az amplifikáció után a cDNS-molekulákat enzimatikusan fragmentáltuk, a végeket javítottuk és A-farkúvá tettük. A feldolgozott cDNS-molekulák megfelelő méretének SPRI gyöngyökkel (Beckman Coulter) történő, kettős méretszelekcióval történő kiválasztása után adaptorral ligáltuk őket, és mintaindex PCR-t végeztünk. Az SPRI gyöngyökkel történő újabb kétszeres méretszelekciót követően a végleges könyvtárkonstrukciókat 10-szeresére hígítottuk, és a minőségellenőrzés céljából lefuttattuk az Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip-en. Az egysejtes könyvtárakat ezután az Illumina HiSeq-X platform segítségével szekvenáltuk.

Egysejtes RNS-adatok előfeldolgozása

A nyers szekvenálási adatokat először a 10X Genomics Cell Ranger 3.0.2 eszközkészletével (http://10xgenomics.com) de-multiplexáltuk és egér referencia genomra (mm10) térképeztük. A Seurat R-csomag (3.0.0 verzió)52 segítségével a nyers expressziós mátrixokat a Read10X funkció segítségével építettük fel. Az 1000-nél kevesebb vagy 6000-nél több detektált gént tartalmazó (potenciális kettősnek tekintett) sejteket kizártuk (17a. kiegészítő ábra). Ezenkívül a magas mitokondriális génhez kapcsolódó egyedi molekuláris azonosító (UMI) számmal rendelkező sejteket (>7%) halott sejteknek tekintettük, és így kizártuk őket. A gének esetében a 3-nál kevesebb sejt által kifejezetteket eltávolítottuk. Ezenkívül a klaszterezés első körét követően kis számú szennyező Ptprc+ immunsejtet és Pecam1+ Cdh5+ endotélsejtet kizártunk. A nem kívánt sejtek és gének eltávolítása után az egyes gének UMI-számát egy sejt esetében elosztottuk az adott sejt teljes expressziójával, majd megszoroztuk 10 000-rel és log-transzformáltuk. Ezután a géneket skáláztuk és központosítottuk olyan változók regressziójával, mint a mitokondriális gének százalékos aránya és az UMI-k száma.

Változó gének azonosítása és dimenziócsökkentés

A klaszterezési elemzéshez a Seurat R csomagot használtuk. Először a Seurat FindVariableFeatures funkciójával azonosítottuk a nagymértékben változó géneket az adathalmazban, a következő opcióval: selection.method = “vst”. A 2000 legnagyobb variabilitású gént választottuk ki a downstream elemzéshez. Az azonosított változó gének felhasználásával kezdeti dimenziócsökkentést végeztünk a főkomponens-elemzés (PCA) segítségével. A PCA pontszámok statisztikai szignifikanciájának meghatározására a JackStraw funkciót használtuk. A legjelentősebb 30 főkomponenst (PC) használtuk az Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) bemenetként, hogy az adatokat kétdimenziós térbe redukáljuk.

Klaszterelemzés

A sejtek transzkripciós profiljuk szerinti klaszterezése érdekében mind a négy minta esetében felügyelet nélküli klaszterezést végeztünk a 2000 legjobban változó génen. Először a FindNeighbors függvény segítségével létrehoztuk a megosztott legközelebbi szomszédok (SNN) gráfját a főkomponens-térben. Ezután Louvain algoritmust alkalmaztunk a modularitás-optimalizáláson alapuló klaszterezéshez a FindClusters függvény használatával. A klaszterezési felbontási paramétereket azon a ponton állítottuk be, ahol a klaszterek erősen eltérő transzkripciós profilokat mutattak. A klaszterezések függetlenek voltak a sejtenként detektált gének számától (17b. kiegészítő ábra). A klaszter-specifikus markerek a Seurat FindMarkers funkciójával azonosított, differenciálisan expresszált gének voltak minden klaszterben, a következő beállításokkal: min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15,test.use = “MAST”. Az azonosított markereket korrigált P < 0,05 értékkel használtuk a további elemzéshez. Mivel egyes sejttípusok, mint például a simaizomsejtek és a falsejtek jól ismert markerekkel rendelkeztek, megjelenésük az egyes klaszterek markerlistájának élén validálta a marker kiválasztási folyamatainkat. Az eltérések nem kívánt forrásának, például a nemnek az eltávolítása érdekében a sejteket a női specifikus Xist transzkript jelenléte és integrálása alapján osztottuk fel. A különböző adatkészletek integrálásához először lognormáltuk az egyes nyers expressziós mátrixokat, és minden adatkészlet esetében azonosítottuk a 2000 legnagyobb mértékben változó gént. Ezután a Seurat FindIntegrationAnchors funkciójának segítségével azonosítottuk az adatkészletek közötti horgonyokat. Ezután az adatkészleteket az azonosított horgonyok alapján integráltuk a Seurat IntegrateData funkciójával. Az integrált adatkészleteket ezután skáláztuk, és a dimenziókat csökkentettük a további klaszterelemzéshez. Az integrált adatkészletekben lévő klasztereket az azonosított makerlistákon szereplő gének expressziós profiljai alapján annotáltuk.

Geneontológiai dúsítási elemzés

A klasztermarkereken a génontológiai dúsítási elemzést a goseq R csomag (1.34.0 verzió)53 segítségével végeztük el. A gén hosszától függően súlyokat kaptunk az egyes génekre, és a Wallenius-féle közelítést használtuk a kapcsolódó génontológiai kifejezések azonosítására. Azokat a génontológiai kifejezéseket választottuk ki, amelyek korrigált P < 0,05 és biológiai folyamat kategóriákkal rendelkeznek.

Statisztika

A minta méretének előzetes meghatározására nem használtunk statisztikai módszereket. A kísérletek randomizáltak voltak, és a vizsgálók vakok voltak az allokációra a kísérletek és az eredményelemzések során. Minden értéket átlag ± standard deviáció (SD) értékként mutatunk be. A statisztikai szignifikanciát a kétoldali Mann-Whitney U-teszttel határoztuk meg két csoport között, vagy a kétirányú ANOVA-t Holm-Sidak többszörös összehasonlítási teszttel több csoportos összehasonlítás esetén. A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software) segítségével végeztük. Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.