1 Elmélet
Az oligonukleotidokat egy szilárd fázisú hordozóhoz kötött, a 3′ végétől az 5′ végéig terjedő bázis egyenkénti hozzáadásával szintetizálják. Amikor az oligonukleotid kémiai szintézise befejeződött, a DNS-láncot ammónium-hidroxiddal történő inkubálással leválasztják a szilárd hordozóról. Az ammónium védőtlenítőként is működik, leválasztja a foszfátokat védő csoportokat a foszfodiészterkötésekben. Ezt követően forró ammóniát adunk hozzá, hogy hidrolizálja a védőcsoportokat a dezoxiadenozin, dezoxicitozin és dezoxiguanozin exociklusos aminocsoportjairól. Az oligonukleotidot az ammóniaoldatban, nyers készítményként lehet a felhasználó rendelkezésére bocsátani. Ebben az esetben a felhasználás előtt szükség lehet egy további lépésre, hogy az oligonukleotid-készítményből eltávolítsák a védőtlenítés során keletkezett sókat és melléktermékeket.
A védőtlenítést követően az oligonukleotid-készítményt általában sótalanítják, mennyiségi meghatározást végeznek, liofilizátorban szárazra párolják, és por formájában szállítják a felhasználónak. A sótalanított oligonukleotid-oldat tartalmazza a teljes hosszúságú oligonukleotidot, de a kémiai szintézis során felhalmozódott csonka termékek keverékét is. A csonkolódás akkor következik be, amikor a megadott bázis a megfelelő ciklusban nem adódik hozzá a lánchoz (Hecker & Rill, 1998). Így a preparátumban felhalmozódó csonka termékek százalékos arányát a szintézis hatékonysága (a teljes hosszúságú termék aránya a szintézis után) és a molekula hossza határozza meg. A hosszú oligonukleotidok, amelyek szintéziséhez több ciklusra van szükség, kevésbé tiszták, mint a rövid oligonukleotidok. Ezek a hibák bizonyos alkalmazásokban versenyezhetnek a teljes hosszúságú termékkel, és az oligonukleotid felhasználása előtt eltávolításra szorulhatnak. A sótalanított oligonukleotid-készítmények azonban általában számos alkalmazáshoz, például a standard PCR-hez vagy a microarray-khez alkalmasak, különösen, ha az oligonukleotid < 20 nukleotid hosszúságú.
Az 50 bázisnál hosszabb oligonukleotidok esetében további tisztítás ajánlott, mivel a teljes hosszúságú termék aránya a készítményben általában nem haladja meg a 80%-ot. Igényes alkalmazásoknál, ahol az oligonukleotid pontos hossza fontos, mint például géleltolódási próbák, hely-irányított mutagenezis, szekvenálás, klónozási adapterek előállítása vagy könyvtárak létrehozására szolgáló elsőszálú cDNS-szintézis, további tisztítás ajánlott, még rövidebb oligonukleotidok esetében is (lásd a fenti technikákkal kapcsolatos további információkat a fehérje-nukleinsav kölcsönhatások standard in vitro próbái – RNS- és DNS-kötési géleltolódási próbák és hely-irányított mutagenezis).
Szintézis után vagy az oligonukleotid enzimatikus módosítása után tisztításra lehet szükség. Ennek elérésére többféle módszer létezik, és a választás az oligonukleotid jellegétől és a felhasználási céltól függ.
A fordított fázisú HPLC-tisztítás a hidrofobicitáson alapul. Nem poláros állófázist, valamint vizes puffereket és szerves oldószereket használ mozgófázisként az analitok eluálásához; a poláros vegyületek először eluálódnak, míg a nem poláros vegyületek visszamaradnak. Ez a legjobb módszer hidrofób csoporttal módosított oligonukleotidok, például biotin, fluoreszcens festékcímkék vagy NHS-észter konjugációk tisztítására. A tömegvisszanyerés nagyobb, mint a PAGE-tisztítás alkalmazásakor, és alkalmas nagyobb mennyiségű oligonukleotidok tisztítására (mmolos skálán), bár a nem teljes termékeket nem távolítja el olyan hatékonyan. A fordított fázisú kromatográfián alapuló oligonukleotid-tisztító patronok gyors módszert biztosítanak az oligonukleotidok sótalanítására és tisztítására.
A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) az oligonukleotidokat hosszuk szerint oldja fel, és ezáltal elegendő felbontást biztosít a teljes hosszúságú termékeknek a sikertelen molekuláktól való megkülönböztetéséhez (Atkinson és Smith, 1984). A poliakrilamid gélek hatékonyabban választják el a kis DNS-fragmentumokat, mint az agaróz gélek (lásd: RNS elemzése analitikus poliakrilamid gélelektroforézissel és agaróz gélelektroforézissel). A poliakrilamid gélek egyetlen hátránya, hogy nehezebb elkészíteni és kezelni őket, mint az agaróz géleket. A poliakrilamid géleket függőleges elrendezésben, állandó elektromos térben futtatják. Az elektroforézis után az oligonukleotidot a gélből eluáljuk és koncentráljuk, etanolos kicsapással (a nukleinsavak kicsapásáról bővebben az RNS-tisztítás – kicsapási módszerek oldalon olvashat) vagy fordított fázisú kromatográfiával. Ez a módszer a választás, ha igényes alkalmazásokhoz a teljes hosszúságú oligonukleotidok legnagyobb százalékos arányára van szükség. A 30 bázisnál hosszabb oligonukleotidok esetében is erősen ajánlott. Emellett egyszerre több minta is lefuttatható, és nincs szükség drága berendezésre. A technika egyetlen hátránya a tisztításonként nyert oligonukleotid kis mennyisége. Az oligonukleotidokat jellemzően 1 μmol vagy annál kisebb mennyiségben használják, és a PAGE-tisztítás utáni tömegvisszanyerés < 50%, módosított oligonukleotidok esetében pedig még ennél is alacsonyabb. Mindazonáltal, bár a hozam alacsony, a legtöbb biokémiai alkalmazáshoz kielégítő.
Az oligonukleotid-készítményt denaturáló poliakrilamid gélre töltjük, sávonként legalább 1 mg mennyiségben. A gél felbontási tartománya a poliakrilamid koncentrációjától függ. Rövid oligonukleotidok (15 és 35 bázis között) esetén 13-15%-os poliakrilamid gélek alkalmazása javasolt; hosszabb oligonukleotidok (35 és 70 bázis között) esetén 8-13%-os poliakrilamid gélek alkalmazása javasolt. A gél százalékos arányát a futórendszerhez kell igazítani. Mi általában a Bio-Rad Mini Protean II rendszert használjuk, és 15%-os géleket futtatunk a 25 bázis hosszúságú oligonukleotidok tisztításához. A megfelelő sáv UV-vizualizációval történő azonosítása után a sávot kivágjuk és kivonjuk a gélből.
Az oligonukleotidok poliakrilamid gélekből történő tisztításának két különböző módszerét ismertetjük ebben a fejezetben. A legegyszerűbb módszer a diffúzióval történő eluálás. Ennek alapja a molekulák mozgása egy magasabb koncentrációjú régióból egy alacsonyabb koncentrációjú régióba. A diffúzió eredménye az anyag fokozatos keveredése. Ez a módszer időigényes, de nem igényel túl sok munkát és semmilyen berendezést. Alapvetően az érdeklődésre számot tartó oligonukleotidot tartalmazó poliakrilamid sávot apró darabokra vágjuk, és elúciós pufferrel fedjük le. Az inkubálás után a DNS-t etanolos kicsapással tisztítjuk a felülúszóból. A hozam korlátozott, az oligonukleotid hosszától függően 20% és 70% között van. Minél nagyobb mennyiségű elúciós puffert használunk, annál több oligonukleotid diffundál a gélből.
A második módszer az elektroelúció dializáló zsákba (McDonell et al., 1977). Az oligonukleotidot tartalmazó géldarabot kivágjuk, és egy pufferrel ellátott dialíziszsákba helyezzük. Az elektromos áram alkalmazása hatására a DNS a gélből a dializálózsák pufferébe vándorol. Az oligonukleotidot ebből a pufferből nyerik ki és tisztítják meg. Ezzel a módszerrel az oligonukleotid jó hozammal izolálható, bár időigényes, ha egyszerre nagyszámú mintát tisztítunk, mivel minden egyes gélsávot külön dializálózsákba kell helyezni. Ez a módszer nagyobb DNS-töredékek esetében is jól működik, és akár agaróz gélekből is kivonható vele a DNS.