Főszöveg
A humán Y-kromoszóma hosszának nagy részén közvetlenül az apáról a fiúra száll, ami a genom többi részétől eltérő, hímspecifikus öröklődési mintázatot eredményez. Az Y-kromoszóma fenotípusos tulajdonságainak így könnyen felismerhetőnek kell lenniük a férfi vonalú öröklődésük alapján, és a korai tanulmányok azt állították, hogy számos ilyen tulajdonságot azonosítottak, köztük olyan figyelemre méltó példákat, mint a “szőrös fülek”. Azonban már 1957-ben ezen állítások kritikai vizsgálata nem talált alátámasztást a vizsgált 17 tulajdonság egyikére sem,1 amit a “szőrös fülek” későbbi molekuláris-genetikai elemzése is megerősített.2 Az Y-kromoszómális tulajdonságok talán meglepő hiánya legalább részben két tényező következményeként értelmezhető. Először is, amikor 2003-ban létrehozták az emberi Y-kromoszóma hímspecifikus régiójának referenciaszekvenciáját,3 kiderült, hogy a kromoszóma kevés hímspecifikus gént hordoz, és csak 23 különböző fehérjét kódol. Későbbi munkák megállapították, hogy ezek közül három hiányzik a dél-ázsiai férfiak mintegy 2%-ából, akiknek Y kromoszómája így mindössze 20 hímspecifikus fehérjét kódol.4 Másodszor, az Y kromoszómának speciális funkciói vannak a férfi nemi meghatározásban és a termékenységben, ahol a mendeli variáció valószínűleg nem öröklődik. Így 2004 elején azt lehetett írni, hogy “a törzsfaelemzés még nem mutatott ki egyetlen Y-kötődésű gént”.5 Még ugyanebben az évben azonban egy kínai családban jelentették az Y-kötődésű halláskárosodást (DFNY1, MIM 400043),6 és ez maradt az egyetlen dokumentált mendeli rendellenesség, amely Y-kötődést mutat az emberekben. Alapja tehát valószínűleg szokatlan, és jelentős érdeklődésre tart számot. Itt ezt az alapot vizsgáljuk a DFNY1 Y-kromoszóma szekvenciájának vizsgálatával és összehasonlításával a család egy közeli rokon, de nem érintett ágának Y-kromoszómájával.
A 2004-ben bejelentett hétgenerációs DFNY1 törzskönyvben minden felnőtt férfi érintett volt.6 Ezt követően a törzskönyvet további két generációra visszavezettük, és egy korábbi ős további férfi leszármazottait azonosítottuk.7 Feltűnő módon az ő hallásuk nem volt érintett (1. ábra). Korábban kimutattuk a család két ágából származó Y-kromoszómák azonosságát 67 Y-STR lókuszon, ezért arra következtettünk, hogy az ágak közötti fenotípusos különbségnek egy olyan genetikai variánshoz kell kapcsolódnia, amelyet kifejezetten az érintett ág Y-kromoszómája hordoz. Áramlási citometriával mindkét ágból kiválogattunk egy-egy reprezentatív Y-kromoszómát, majd szekvenáltuk. A kromoszómák között mindössze négy bázis-szubsztitúciós különbséget azonosítottunk.8 Ezek közül három az érintetlen ágon keletkezett. A negyedik az érintett ágon keletkezett, és a fenotípussal együtt szegregálódott, de nem volt jó jelölt az okozó mutációra, mivel kívül esett bármelyik annotált génen. Bár ez az elemzés nem tudta értékelni a kromoszóma ismétlődő régióit, az ismert ismétlődő gének főként a spermatogenezisben vesznek részt,3,9 ezért a jelenlegi vizsgálatban azt a lehetőséget vizsgáltuk, hogy az okozó mutáció esetleg nem pontmutáció. Ezt a vizsgálatot a mintadonorok, akik írásbeli beleegyezésüket adták, és a kínai PLA Általános Kórház (Peking, Kína) orvosi etikai bizottsága jóváhagyta.
A DFNY1 törzskönyv
Hímek, négyzetek; nőstények, körök; átlós vonal, elhunytak. A kitöltött szimbólumok halláskárosodást jeleznek (többek között a családi feljegyzésekből); a kérdőjelek két olyan egyént jelölnek, akiknek a hallás fenotípusa ismeretlen; a csillagok pedig olyan egyénekre utalnak, akik az érintett ágon vannak, de a vizsgálat idején a tünetek megjelenésének kora alatt voltak. A nyilak azt a két egyént jelölik, akiknek Y kromoszómáját szekvenálták. A strukturális átrendeződés a piros csillagokkal jelölt négy meiózis egyike során következett be. A VII-IX. generációkban és a VI. generációban a nem érintett ágon a házastársak kimaradtak.
Megvizsgáltuk a relatív olvasási mélységet a kromoszóma mentén úgy, hogy a kiváló minőségű, duplikátumszűrt olvasatokat a chrY referenciaszekvenciához igazítottuk a Sequence Search and Alignment by Hashing Algorithm 2 (SSAHA2)10 segítségével, és összehasonlítottuk az olvasatok számát 10 kb binonként az érintett VIII-2 egyed (1. ábra) és az érintetlen VII-24 egyed (1. ábra) Y-kromoszómái között. Ez három, az érintett kromoszómában megduplázott, diszkontinuus szegmenst mutatott ki, és mindegyik a ∼9,3 Mb-nál végződő TSPY1 (MIM 480100) génklaszter és a ∼10,1 Mb-nál lévő centromerikus rés közötti korlátozott régióból származott (2A ábra). Ezeket a duplikációkat hagyományos oligonukleotid tömbös összehasonlító genomikai hibridizációval (CGH) igazoltuk egy, a teljes genomot lefedő Agilent 1 millió tömb és egy egyedi NimbleGen 385K tömb segítségével, amely a chrY: 2 000 000-10 715 000 (1 990 000-10 105 000 hg19) pozíciókat nagy (∼20 bp) felbontással fedte le (2B ábra). Mivel ezek a TSPY1 génklaszter egy részét foglalták magukban, a TSPY1 génszámának növekedését qPCR (S1 táblázat az online elérhető kiegészítő adatokban) és pulzálómezős gélelektroforézis (PFGE; S1 ábra) segítségével igazoltuk. Ezek az elemzések azt mutatták, hogy a duplikáció az összes vizsgált érintett családtagban közös volt, és hiányzott az összes nem érintett tagból, valamint azt is, hogy a duplikáció az eredeti TSPY1-klasztertől különálló restrikciós fragmentumban helyezkedett el, és így nem volt összefüggő. Bár a kombinált bizonyítékok megerősítették a 9,3-10,1 Mb-os régió komplex duplikációját, nem adtak információt arról, hogy a duplikált szekvenciák hol épültek be. A metafázisban végzett fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) egy TSPY1-szondával egyetlen jelet mutatott (nem látható), ezért a nagyobb felbontás érdekében a korábban leírt módon11 szál-FISH-t alkalmaztunk. Az Y-kromoszómális szondák BAC-klónok voltak, amelyek a ∼9,3-10,1 Mb referencia-szekvencia nagy részét lefedték: RP11-334D2 (beleértve a TSPY1-et), RP11-182H20, RP11-155J5, RP11-160K17 és RP11-108I14 (beleértve a centromerikus szekvenciákat). Az eredmények (2C. ábra) azt mutatták, hogy a nem érintett kromoszóma ugyanúgy szerveződött, mint a referenciaszekvencia, ami a TSPY1-182H20-centromerben foglalható össze. Ezzel szemben az érintett kromoszóma (2D. ábra) megszakadt a 182H20 szekvencián belül, így a TSPY1-parciális 182H20-rés-centromerikus duplikáció-TSPY1-duplikáció-182H20-centromer szervezet jött létre. A szál-FISH eredmények tehát azt mutatták, hogy a duplikált Y-szekvenciák helyileg átrendezett formában kerültek vissza, de egy olyan szegmens jelenlétét is kimutatták, amely nem hibridizálódott a TSPY1-centromer régióból származó egyetlen szondával sem.
A DFNY1 Y-kromoszóma által hordozott szerkezeti átrendeződés jellemzése
(A) Relatív olvasási mélység (érintett/nem érintett) az Y-kromoszóma referenciaszekvenciájára leképezett 10 kb-os bunkerekben 9,3 és 10,1 Mb között. Figyeljük meg az assembly hézagokat e régió mindkét végén.
(B) CGH log2 arány (érintett/nem érintett) ugyanerre a régióra.
(C) A nem érintett Y-kromoszómához jelzett három BAC-klón Fiber-FISH-je, ami azt mutatja, hogy az hordozza a referenciaszerkezetet ebben a régióban. Mind a 334D2, mind a 108I14 a BAC-klón méreténél nagyobb tandemtömböket detektál.
(D) Ugyanezen BAC-klónok Fiber-FISH-ja az érintett Y-kromoszómához. Ez a kromoszóma olyan inszerciót hordoz, amely megszakítja a 182H20-hibridizáló régiót, és mind a 334D2-, mind a 108I14-hibridizáló szekvenciák részleges duplikációit tartalmazza.
(E) Az érintetlen és az érintett Y-kromoszóma leolvasásainak abszolút mélysége a 160-hoz.15-160,35 Mb régiójához képest.
(F) CGH log2 arány (érintett/érintetlen) ugyanerre az 1. kromoszóma régióra.
(G) Az 1. kromoszóma 179G5 BAC-klónjának metafázis FISH-je az érintetlen Y-kromoszómán (sárga). A hibridizáció csak az 1. kromoszómán lévő referenciahelyen látható.
(H) Ugyanennek az 1. kromoszóma szondának metafázis FISH-ja az érintett Y kromoszómán (sárga). A hibridizáció az Y kromoszómán egy további lokuszon látható.
(I) A két jelzett Y BAC klón, valamint az 574F21, 179G5 és 1365F20 kromoszóma-1 klónok szálas-FISH-ja az érintetlen Y kromoszómára. Az Y-on nem észlelhető 1. kromoszóma jel.
(J) Ugyanezen klónok Fiber-FISH-ja a nem érintett Y kromoszómához. Az 1. kromoszóma klónjai jelet detektálnak az Y-on a 182H20 részleges jel és a 108I14 jel között. A genomkoordináták a GRCh37/hg19-re vonatkoznak.
Az ismeretlen szekvenciák azonosítása érdekében a 182H20 töréspontból a résbe nyúló szakaszon termikus aszimmetrikus interlaced PCR-t (TAIL-PCR)12 végeztünk az S2. táblázatban szereplő primerek segítségével. Az egymást követő amplifikációk során ez az eljárás az ismert szekvenciára specifikus, egymásba ágyazott primereket olyan degenerált primerekkel párosítja, amelyek várhatóan az ismeretlen flankáló szekvenciát választják ki. A jelölt kapcsolódási termékeket felismerjük, mivel az egymást követő reakciókban a méretkülönbségek az ismert primerpozíciókat tükrözik. A töréspont-specifikus primerekkel megerősített szomszédos szekvenciák (S3. táblázat és S2. és S3. ábra) az 1-es kromoszómáról (160,16 Mb) származnak, és a leolvasási mélység, a CGH-profilok (2E. és 2F. ábra) és a szekvencia vizsgálata egy ∼160 kb-os összefüggő régió érintettségére utalt; ezt az érintettséget egy második, összetettebb, 160,32 Mb-os kromoszóma-1Y csomópont azonosítása is alátámasztotta. Az 1. kromoszóma szekvenciáinak transzlokációját az érintett Y-ba metafázis FISH-vel igazoltuk (2G és 2H ábra), és az Y-duplikáció résén belüli elhelyezkedésüket rost-FISH-vel (2I és 2J ábra) erősítettük meg az 1. kromoszómáról származó RP11-574F21, RP11-179G5 és W12-1365F20 BAC-okat szondaként használva. A kombinált adatok így egy komplex duplikációs struktúrát mutattak ki, amely mind az 1. kromoszóma fragmentumából, mind az Y DNS több szegmenséből áll (S4. táblázat és S2. és S3. ábra). A szekvenált töréspontok egyike sem mutatott kiterjedt hosszúságú homológiát, de mindegyik mikrohomológiát mutatott, ami a FoSTeS (fork stalling and template switching) mintázatára utal, ami egy olyan mechanizmus, amely a replikáció során különböző genomiális fragmentumokat egyesít.13
Az itt megfigyelt duplikációs struktúráról máshol nem számoltak be, és mindössze négy meiózis egyike során keletkezhetett, ami magában foglalja azt a meiózist, amelyben maga a DFNY1 mutáció bekövetkezett (1. ábra). Ezért valószínűsíthető, hogy ok-okozati összefüggésben áll. A duplikált Y-kromoszómális szekvenciák csak egy ismert fehérjét, a TSPY1-et kódolják a ∼10 TSPY1 gének tandemsorozatából, míg az 1-es kromoszóma szekvenciái öt RefSeq gént (CASQ1 , PEA15 , DCAF8 , PEX19 és COPA ) és egy másik gén, az NCSTN (MIM 605254) 5′ végét hordozzák (1-3. exon; 3. ábra). Azok a mechanizmusok, amelyek révén a duplikáció a siketség fenotípusához vezethet, magukban foglalják a gén kópiaszámának növekedését, az új kísérő DNS-ből eredő nem megfelelő expressziót, vagy egy módosított termék kialakulását csonkítás, fúzió vagy pontmutáció révén. A DFNY1 családból nem állnak rendelkezésre expressziós adatok, és az 1. kromoszóma RefSeq génekben nem találtunk nem-szinonim mutációkat (S5. táblázat). A TSPY1 kópiaszám polimorf a populáción belül,14 és nagyobb TSPY1 kópiaszámot találtak siketségről szóló jelentések nélkül, többek között 47,XYY egyénekben is; egy tanulmány a magas TSPY1 kópiaszámot egy másik fenotípussal, meddőséggel hozta összefüggésbe.15 A megnövekedett TSPY1 kópiaszám tehát rossz jelölt a siketségre. Ezzel szemben az 1. kromoszóma régiója teljes egészében egy körülbelül 900 kb-os intervallumon, a DFNA49-en (MIM %608372) belül fekszik, amelyet korábban halláskárosodással hoztak összefüggésbe; az okozó mutáció ebben az intervallumban továbbra is ismeretlen.16 Ezért azt javasoljuk, hogy ugyanaz a gén vagy gének állhatnak mind a DFNA49, mind a DFNY1 fenotípus hátterében. A legegyszerűbb mechanizmus e gének közül egy vagy több gén dózisérzékenysége lenne, oly módon, hogy a három másolatból eredő fokozott expresszió halláscsökkenéshez vezet, bár más mechanizmusok sem zárhatók ki.
A nem érintett és az érintett Y-kromoszómák szerkezete és géntartalma
(A) A nem érintett (VII-24 az 1. ábrán) Y-kromoszóma szerkezete. Szürke és fekete: hibák, illetve hiányosságok a GRCH37 összeállításában. Kék: a referenciaszekvenciával megegyező régió az alkalmazott felbontási szinten. Alul a TSPY1 tömb egy része (kék nyílhegyek) és a 2. ábrán azonosított BAC-klón jelek helye látható.
(B) Az érintett (VIII-2 az 1. ábrán) Y-kromoszóma szerkezete. Ez a kromoszóma tartalmaz egy olyan szegmenst, amely nem található az érintetlen kromoszómában; ez a szegmens az 1. kromoszómából (sárga) és az Y-kromoszómából (kék) származó szekvenciák duplikációjából származik. Ismét a géntartalom és a BAC-jelek alább láthatóak. A fenti nyílhegyek jelzik a duplikált szegmensek orientációját a referenciaszekvenciához képest.
(C) A szekvencia-szinten vizsgált két kromoszóma 1-Y csomópont részletes nézete (S2 és S3 ábrák), amely mutatja a különbséget az 1-es csomópont egyszerű szerkezete és a 2-es csomópont komplex szerkezete között.
Megállapítottuk, hogy az emberi Y-kötődésű mendeli rendellenesség oka inkább az 1. kromoszóma szekvenciáinak beillesztésével, mint egy Y-kromoszómális gén mutációjával függ össze. Ez összhangban van azokkal a megfigyelésekkel, hogy sem a teljes Y-kromoszóma és így annak összes génjének duplikációja (47,XYY kariotípus), sem deléciója (45,X kariotípus) nem jár együtt halláskárosodással, ami arra utal, hogy egy Y-kromoszómális gén funkcióvesztése vagy duplikációja nem valószínű, hogy a DFNY1 fenotípus hátterében áll. Az átrendeződés összetettsége szintén összhangban van a ritkaságával: Bár a férfi vonalas siketségnek könnyen felismerhető fenotípusnak kellene lennie, tudomásunk szerint csak egyetlen további családról számoltak be hasonló fenotípussal.17 A két család közötti kapcsolat ismeretlen; a második család szintén kínai, de más etnikai csoportból (Han helyett Tujia) származik. Az audiológiai jellemzők azonban hasonlóak, és a jelenlegi ismeretek alapján nem zárható ki a közös eredet. E sajátos átrendeződés ritkasága ellenére mégis úgy tekintjük, hogy az autoszomális szekvenciák Y-kromoszóma általi átvétele az Y-kromoszóma evolúciójának szokásos része, általában semleges, és esetenként fixációig jut, bár a DFNY1 esetében ez hátrányos. Valóban figyelemre méltó, hogy az Y-kromoszóma az 1q43 kromoszómarégióból ∼100 kb fixált inszerciót hordoz a proximális Yq-ban,18 közel a DFNY1 inszercióhoz. Ez a megfigyelés felveti a kérdést, hogy a sejtmagban való közelség nem kedvez-e a DNS-transzfernek e két kromoszóma között.19 A javasolt DFNY1 mutációs mechanizmust, a FoSTeS-t, korábban csak intrakromoszómális átrendeződésekkel hozták összefüggésbe,13 ezért a jelenlegi tanulmány kiterjeszti a hatását az interkromoszómális átrendeződésekre is; továbbá rávilágít arra, hogy jobban meg kell érteni a kópiaszám-variáció és a halláskárosodás közötti elhanyagolt kapcsolatot.20