Prima della disponibilità dei computer, la determinazione dei valori di KM e Vmax richiedeva la manipolazione algebrica dell’equazione di Michaelis-Menten di base. Poiché Vmax si avvicina asintoticamente (vedi figura 8.11), è impossibile ottenere un valore definitivo da un tipico grafico di Michaelis-Menten. Poiché KM è la concentrazione del substrato a Vmax/2, è altrettanto impossibile determinare un valore accurato di KM. Tuttavia, Vmax può essere accuratamente determinato se l’equazione di Michaelis-Menten è trasformata in una che dà un grafico a linea retta. Prendendo il reciproco di entrambi i lati dell’equazione 23 si ottiene
Un grafico di 1/V0 rispetto a 1/, chiamato grafico Lineweaver-Burk o doppio reciproco, produce una linea retta con un’intercetta di 1/Vmax e una pendenza di KM/Vmax (Figura 8.36). L’intercetta sull’asse x è -1/KM.
Figura 8.36
Un grafico a doppia reciprocità o Lineweaver-Burk. Un grafico a doppia reciprocità della cinetica enzimatica è generato tracciando 1/V0 come funzione 1/. La pendenza è il KM/Vmax, l’intercetta sull’asse verticale è 1/Vmax, e l’intercetta sull’asse orizzontale (più…)
I grafici a doppia reciprocità sono particolarmente utili per distinguere tra inibitori competitivi e non competitivi. Nell’inibizione competitiva, l’intercetta sull’asse y del grafico di 1/V0 contro 1/ è la stessa in presenza e in assenza dell’inibitore, anche se la pendenza è aumentata (Figura 8.37). Il fatto che l’intercetta sia invariata è dovuto al fatto che un inibitore competitivo non altera la Vmax. Ad una concentrazione sufficientemente alta, praticamente tutti i siti attivi sono riempiti dal substrato, e l’enzima è pienamente operativo. L’aumento della pendenza del grafico 1/V0 contro 1/ indica la forza di legame dell’inibitore competitivo. In presenza di un inibitore competitivo, l’equazione 31 è sostituita da
in cui è la concentrazione dell’inibitore e Ki è la costante di dissociazione del complesso enzima-inibitore.
Figura 8.37
Inibizione competitiva illustrata su un grafico a doppia reciprocità. Un grafico a doppia reciprocità della cinetica enzimatica in presenza (
)e in assenza (
) di un inibitore competitivo illustra che l’inibitore non ha effetto sulla Vmax ma aumenta il KM.
In altre parole, la pendenza del grafico è aumentata del fattore (1 + /Ki) in presenza di un inibitore competitivo. Consideriamo un enzima con un KM di 10-4 M. In assenza di inibitore, V0 = Vmax/2 quando = 10-4 M. In presenza di 2 × 10-3 M inibitore competitivo che è legato all’enzima con un Ki di 10-3 M, il KM apparente (KappM ) sarà uguale a KM × (1 + /Ki), o 3 × 10-4 M. La sostituzione di questi valori nell’equazione 23 dà V0 = Vmax/4, quando = 10-4 M. La presenza dell’inibitore competitivo dimezza quindi la velocità di reazione a questa concentrazione di substrato.
Nell’inibizione non competitiva (Figura 8.38), l’inibitore può combinarsi sia con l’enzima che con il complesso enzima-substrato. Nell’inibizione non competitiva pura, i valori delle costanti di dissociazione dell’inibitore e dell’enzima e del complesso inibitore-enzima-substrato sono uguali (sezione 8.5.1). Il valore di Vmax è diminuito ad un nuovo valore chiamato Vappmax, e così l’intercetta sull’asse verticale è aumentata. La nuova pendenza, che è uguale a KM/Vappmax, è maggiore dello stesso fattore. In contrasto con Vmax, KM non è influenzato dalla pura inibizione non competitiva. La velocità massima in presenza di un inibitore non competitivo puro, Vimax, è data da
Figura 8.38
Inibizione non competitiva illustrata su un grafico a doppia reciprocità. Un grafico a doppia reciprocità della cinetica enzimatica in presenza (
) e in assenza (
) di un inibitore non competitivo mostra che KM è inalterato e Vmax è diminuito.