Burden of Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii Infection in Hospitalized Patients in a Tertiary Care Hospital of Nepal

Introduzione

Acinetobacter baumannii is an aerobic, non fermentativo, gram-negativo, non mobile, cocco-bacilli che ospita una serie di fattori di virulenza efficaci.1 L’organismo è in grado di sopravvivere in un’ampia gamma di condizioni ambientali e persiste per lunghi periodi di tempo sulle superfici, il che lo rende una causa frequente di focolai di infezione e di infezioni associate all’assistenza sanitaria.2 Il problema principale causato da A. baumannii nell’ambiente ospedaliero riguarda soprattutto i pazienti gravemente malati nelle unità di terapia intensiva (ICU), soprattutto quelli che richiedono la ventilazione meccanica, e i pazienti con ferite o ustioni. Le infezioni associate all’A. baumannii includono polmonite associata al ventilatore, infezioni della pelle e dei tessuti molli, infezioni delle ferite, infezioni del tratto urinario, meningite secondaria e infezioni del flusso sanguigno.3

Acinetobacter baumannii è emerso come un significativo patogeno nosocomiale MDR in tutto il mondo ed è stato segnalato sempre più spesso nell’ultimo decennio, probabilmente a causa del crescente uso di antibiotici ad ampio spettro nei pazienti ospedalizzati.4 La Infectious Diseases Society of America (ISDA) ha indicato A. baumannii come uno dei patogeni di “allarme rosso” che minacciano fortemente l’utilità del nostro attuale armamentario antibatterico.5 Numerosi studi hanno indicato una tendenza all’aumento della prevalenza di MDR A. baumannii, ma i tassi di resistenza possono variare ampiamente a seconda del singolo ospedale, città o paese coinvolto. Poiché l’infezione da Acinetobacter MDR si verifica di solito in pazienti gravemente malati, il tasso di mortalità grezzo associato è elevato e varia dal 26% al 68%.6

A. baumannii multiresistente ha sviluppato resistenza alla maggior parte degli antibiotici disponibili, compresi i carbapenemi, che sono i farmaci di scelta nel trattamento delle infezioni gravi.7 Il meccanismo principale della resistenza ai β-lattamici in A. baumannii corrisponde alle pompe di efflusso, alle mutazioni della porina e alla produzione di enzimi di idrolisi dei β-lattamici acquisiti, cioè la classe A (β-lattamasi a spettro esteso, ESBL), la classe B (metallo-β-lattamasi, MBL), la classe C Ampicillinasi (AmpC) e la classe D β-lattamasi. La resistenza ai carbapenemi dovuta alla produzione di MBL e di altre carbapenemasi ha un potenziale di rapida diffusione in ambiente ospedaliero, poiché è spesso mediata da plasmidi e la rilevazione precoce della resistenza ai farmaci è necessaria per una corretta selezione degli antibiotici per trattare le infezioni da A. baumannii nei pazienti ospedalizzati e per avviare efficaci misure di controllo delle infezioni per prevenire la loro diffusione in ambiente ospedaliero.8,9

Tenendo presente quanto sopra, lo studio è stato condotto su A. baumannii isolato da pazienti ospedalizzati per determinare i loro modelli di suscettibilità antibiotica, per identificare i ceppi MDR e per rilevare varie β-lattamasi tra gli isolati MDR.

Materiali e metodi

Lo studio basato sul laboratorio è stato condotto presso il Dipartimento di microbiologia clinica, Tribhuvan University Teaching Hospital (TUTH), un centro di cura terziario del Nepal da gennaio 2017 a dicembre 2017 (per un periodo di 12 mesi). Tutti i campioni clinici raccolti dai pazienti ricoverati con sospette infezioni che rappresentano diversi siti corporei (espettorato, lavaggio broncoalveolare, aspirato endotracheale, campioni di pus e tamponi, diversi fluidi corporei, urina, sangue, punte di cateteri, ecc.) sono stati trattati secondo i metodi microbiologici standard raccomandati dalla American Society for Microbiology (ASM) per l’isolamento e l’identificazione di A. baumannii.10

Test di suscettibilità antibiotica (AST)

La suscettibilità degli isolati di A. baumannii contro diversi antibiotici è stata determinata con il metodo di diffusione su disco Kirby-Bauer modificato su agar Mueller-Hinton e interpretata seguendo le procedure standard raccomandate dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), Wayne, USA.11 Il profilo di sensibilità antibiotica di tutti gli isolati di A. baumannii è stato determinato testando contro ampicillina-sulbactam (10/10 μg), ceftazidime (30 μg), gentamicina (10 μg), ciprofloxacin (5 μg), levofloxacin (5 μg), meropenem (10 μg), e imipenem (10 μg). Gli isolati che erano resistenti ad almeno un antimicrobico da tre diversi gruppi di antibiotici di cui sopra (cioè, isolati MDR) sono stati testati anche contro piperacillina (100 μg), piperacillina-tazobactam (100/10 μg), cefotaxime (30 μg), cefepime (30 μg), cotrimoxazolo (25 μg), amikacina (30 μg), doxiciclina (30 μg), polimixina B (300 unità) e colistina solfato (10 μg) da HiMedia Laboratories, India.

Identificazione degli isolati MDR

Gli isolati A. baumannii multiresistenti sono stati identificati secondo le linee guida raccomandate dal Centro europeo per la prevenzione e il controllo delle malattie (ECDC). Gli isolati non sensibili ad almeno un agente antimicrobico in tre o più classi antimicrobiche sono stati identificati come MDR.12

Rilevamento dei produttori di β-lattamasi a spettro esteso (ESBL)

Il test di screening iniziale per la produzione di ESBL è stato eseguito con test con dischi di ceftazidime (CAZ, 30 μg) e cefotaxime (CTX, 30 μg). Gli isolati sono stati considerati come potenziali produttori di ESBL quando la zona di inibizione (ZOI) era <18 mm per CAZ o <23 mm per CTX. Gli isolati che sono stati sospettati di essere produttori di ESBL dallo screen test sono stati ulteriormente testati con il metodo del disco di combinazione (CD) per la conferma della produzione di ESBL, in cui sono stati usati CAZ e CTX da soli e in combinazione con acido clavulanico. Dopo l’incubazione per 16-18 ore a 35±2°C, un aumento della ZOI di ≥5 mm per entrambi gli agenti antimicrobici in combinazione con l’acido clavulanico rispetto alla sua zona di inibizione quando testato da solo, è stato confermato come produttore di ESBL positivo.11

Rilevamento dei produttori di AmpC β-lattamasi

Acinetobacter baumannii che produce una zona di inibizione <18 mm per il disco di cefoxitina (CX, 30 μg) è stato testato per la produzione di AmpC β-lattamasi. La β-lattamasi AmpC è stata rilevata con il test del disco AmpC. In questo metodo, il ceppo indicatore di Escherichia coli sensibile alla cefoxitina (ATCC 25922) è stato inoculato su una piastra MHA standard per formare una coltura a prato e un disco di cefoxitina è stato posizionato. Un disco bianco di 6 mm di diametro inumidito con tampone Tris-EDTA è stato inoculato con poche colonie del ceppo in esame e posto accanto al disco di cefoxitina. Le piastre sono state incubate a 37°C per una notte. Dopo l’incubazione notturna, una rientranza nella zona di inibizione della cefoxitina adiacente al disco contenente il ceppo di prova è stata considerata positiva per la produzione di β-lattamasi AmpC.13

Rilevamento dei produttori di Metallo β-Lattamasi (MBL) e Klebsiella pneumoniae Carbapenemasi (KPC)

Gli isolati sono stati sottoposti al rilevamento della produzione di MBL e KPC quando resistenti al meropenem (MEM, 10 μg). Il metodo del disco meropenem combinato è stato applicato per il rilevamento e la differenziazione di MBL, KPC o co-produttore di KPC/MBL come descritto da Tsakris et al14 In questo test, sono stati utilizzati quattro dischi; (a) MEM = un semplice disco MEM (10 μg), (b) MEM+EDTA = disco MEM (10 μg) con 292 μg di EDTA, (c) MEM+acido fenilboronico (PBA) = disco MEM (10 μg) contenente 400 μg di PBA, e (d) MEM+EDTA+PBA = disco MEM (10 μg) con 292 μg di EDTA e 400 μg di PBA. L’EDTA agisce come inibitore di MBL mentre il PBA è un inibitore di KPC. Il test è stato eseguito inoculando un agar Mueller-Hinton con l’organismo in esame come indicato per il metodo di diffusione standard e sono stati applicati quattro dischi. Dopo un’incubazione di una notte a 37°C, il diametro ZOI intorno ai dischi MEM+EDTA, MEM+PBA e MEM+EDTA+PBA è stato confrontato con quello intorno al disco MEM normale. La produzione di MBL è stata considerata quando il diametro ZOI intorno ai dischi MEM+EDTA e MEM+EDTA+PBA era aumentato di ≥5 mm rispetto al diametro ZOI intorno al solo disco MEM. La produzione di KPC è stata considerata quando il diametro ZOI intorno ai dischi MEM+PBA e MEM +EDTA +PBA era aumentato ≥5 mm rispetto al diametro ZOI intorno al solo disco MEM. La co-produzione di entrambi gli enzimi KPC e MBL è stata considerata quando il diametro ZOI intorno ai dischi MEM + EDTA + PBA è stato aumentato ≥ 5 mm rispetto al diametro ZOI intorno al disco MEM da solo. Va notato che la concentrazione di PBA e EDTA impiegata nel presente studio non ha mostrato alcun effetto rilevabile sulla crescita batterica.

Elaborazione e analisi dei dati

I dati relativi a demografia dei pazienti, campioni, reparti, profili antibatterici, determinanti di resistenza sono stati analizzati utilizzando la versione SPSS 16.0 e interpretati secondo la distribuzione di frequenza e la percentuale.

Risultati

Durante il periodo di studio, sono stati isolati un totale di 177 A. baumannii. Sul totale degli isolati di A. baumannii, la maggior parte di essi (N=161, 91,0%) sono stati identificati come MDR.

Distribuzione degli Acinetobacter baumannii MDR

Su 161 isolati MDR, la maggioranza (47.2%) sono stati isolati da campioni del tratto respiratorio (cioè, espettorato, lavaggio broncoalveolare e aspirato tracheale) seguito da pus e tamponi, fluidi corporei, urina, sangue e meno erano da punte di catetere (1,2%) (Tabella 1). Tra il totale degli isolati MDR, il 58,3% è stato isolato da pazienti maschi e il 41,7% da pazienti femmine, con un rapporto maschi/femmine di 1,4. The highest number of isolates were from male patients with age group ≥65 years (14.9%) and the least number was isolated from a female patient with age group 49–64 years (5.0%) (Table 2). Similarly, the higher number of MDR isolates were isolated from ICU patients (49.6%) followed by surgical wards (19.9%) and medical wards (14.3%), while the lowest number from burn wards (1.9%) (Table 3).

Table 1 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii in Various Clinical Specimens

Table 2 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii by Gender and Age Group of Patients

Tabella 3 Distribuzione per reparto di Acinetobacter baumannii MDR

Antibiogramma di MDR Acinetobacter baumannii

Il profilo di sensibilità antibiotica mostra che la maggior parte degli isolati MDR erano resistenti alla maggior parte deglilinea di antibiotici. Tra questi, tutti gli isolati erano completamente resistenti alla piperacillina e al cefotaxime. Allo stesso modo, il 99,4% era resistente alla ceftazidima e alla cefepime, il 98,7% al cotrimoxazolo, il 95% alla piperacillina-tazobactam e alla ciprofloxacina, il 93,8% alla gentamicina, l’89,4% all’ampicillina-sulbactam e al meropenem. Solo l’11,8%, il 12,4%, il 13,6% e il 37,9% erano sensibili a levofloxacina, imipenem, amikacina e doxiciclina, rispettivamente. Tutti gli isolati MDR erano completamente sensibili solo agli antibiotici di ultima istanza, cioè polimixina B e colistina solfato (Figura 1).

Figure 1 Percentage of antimicrobial resistance and sensitivity of MDR A. baumannii (N = 161).

ESBL, AmpC, MBL, and KPC Production in MDR Acinetobacter baumannii

In this study, the rate of β-lactamases production among MDR isolates was significantly high. MBL was the common β-lactamase detected among MDR A. baumannii (67.7%). ESBL was detected in 19.9%, AmpC in 38.5%, and KPC in 9.3% of MDR isolates. The co-production of different types of β-lactamases was also seen among some isolates. ESBL+AmpC co-producers were seen in 6.8%, ESBL+MBL co-producers in 5.0%, AmpC+MBL co-producers in 23.0% and MBL+KPC in 5.6% of MDR isolates (Table 4).

Table 4 β-Lactamases Production Among MDR Acinetobacter baumannii

Discussione

Acinetobacter baumannii è un importante patogeno nosocomiale associato a un’ampia varietà di malattie nei pazienti ospedalizzati soprattutto nelle unità di terapia intensiva che impone una sfida maggiore alla gestione del paziente e al controllo delle infezioni. L’emergenza mondiale di A. baumannii MDR isolato è di grande preoccupazione.15

Nel nostro studio, A. baumannii MDR è stato isolato frequentemente da campioni del tratto respiratorio (47,2%), seguito da pus e tamponi (27,3%), fluidi corporei (11,1%) e altri. Uno studio è stato fatto da Shrestha et al nel 201515 dallo stesso ospedale anche riportato 49,18% di MDR A. baumannii da campioni del tratto respiratorio e Samawi et al16 dal Qatar riportato 48,9% A. baumannii da infezioni del tratto respiratorio. I dati demografici del nostro studio hanno mostrato un’alta prevalenza di infezioni in pazienti maschi di età ≥65 anni e la maggior parte degli isolati MDR proveniva da pazienti in terapia intensiva, perché questi batteri hanno una predilezione per i gruppi di età più alta e per i pazienti gravemente malati in terapia intensiva.

Il tasso di MDR A. baumannii nel nostro studio è del 91,0% che è molto alto. Anche nello studio fatto da Shrestha et al e Mishra et al, circa il 96% e il 95% di A. baumannii erano MDR, rispettivamente.17,18 Questa alta prevalenza di MDR A. baumannii può essere dovuta all’alta possibilità di diffusione del gene della resistenza e alla loro capacità di presentarsi ovunque nell’ambiente ospedaliero. L’infezione da A. baumannii con alti isolati MDR ci ha anche allarmato sul fatto che c’è bisogno di un ulteriore studio approfondito e dell’applicazione di misure preventive per ridurre una minaccia così temibile nei pazienti ospedalizzati. Gli isolati A. baumannii multiresistenti sono stati trovati significativamente resistenti ai carbapenemi, agli aminoglicosidi e ai gruppi di antibiotici fluorochinolonici in questo studio. Quasi tutti gli isolati MDR erano resistenti alla piperacillina e alle cefalosporine, il 93,8% resistente alla gentamicina e l’89,4% al meropenem, che è superiore a quello riportato da Mishra et al18 dallo stesso ospedale (quasi l’89% e il 50% degli isolati erano resistenti alle cefalosporine e ai carbapenemi, rispettivamente). Uno studio condotto da Xia et al in Cina ha dimostrato la resistenza ai carbapenemi nell’85% degli isolati, che è quasi simile a questo studio.19 Il programma MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) del 2007 ha dimostrato che il 74,1% degli isolati era suscettibile al meropenem e il 78,9% era suscettibile all’imipenem in Europa, rispetto a suscettibilità molto più basse del 51,3% e del 52,0% in diversi paesi asiatici.20,21 Il nostro risultato sul tasso di resistenza all’amikacina era 86.3% che è superiore al 54% nello studio precedente dello stesso ospedale.18 La crescente comparsa di ceppi altamente resistenti agli aminoglicosidi è anche causa di grande preoccupazione. In questo studio, il 95,0% e l’88,2% di A. baumannii MDR erano resistenti rispettivamente alla ciprofloxacina e alla levofloxacina. La resistenza al fluorochinolone sta aumentando rapidamente negli isolati clinici negli ultimi anni a causa del loro ampio uso in medicina clinica come agenti antimicrobici ad ampio spettro. Nel nostro studio, la polimixina B e il solfato di colistina hanno mostrato un effetto eccellente contro l’A. baumannii MDR poiché nessuno degli isolati è stato trovato resistente al solfato di colistina e alla polimixina B. Ma, nello studio di Joseph et al22 e Al-Sweih et al,23 il 20% e il 12% di Acinetobacter spp. erano resistenti al solfato di colistina, rispettivamente. Tuttavia, il presente studio ha mostrato un alto tasso di resistenza agli antibiotici contro gli antibiotici comunemente usati ed è uno svantaggio per il sistema sanitario in paesi come il Nepal in quanto può influenzare notevolmente la gestione del paziente. Questo può essere dovuto all’uso intenso degli agenti antimicrobici in ospedale, alla facile disponibilità e all’uso indiscriminato di questi farmaci fuori dagli ospedali, e molti antibiotici sono disponibili al banco per l’automedicazione. Lo sviluppo della resistenza agli antibiotici è associato a un’alta morbilità e mortalità nei pazienti ospedalizzati, in particolare nelle unità di terapia intensiva.

La diminuita suscettibilità di A. baumannii verso le cefalosporine di terza e quarta generazione potrebbe essere attribuita ai produttori di ESBL o di AmpC β-lattamasi o ad altri meccanismi sottostanti rilevanti. Questo studio ha mostrato che il 19,9% degli A. baumannii MDR era produttore di ESBL. Un tasso simile di ESBL è stato trovato in uno studio precedente di Parajuli et al in pazienti in terapia intensiva.24 Nello studio di Mishra et al,18 solo il 12,9% di Acinetobacter spp. era produttore di ESBL. In uno studio indiano,25 solo il 7% degli isolati di A. baumannii erano produttori di ESBL, mentre un altro studio in India8 ha documentato il 29,9% degli Acinetobacter spp. come produttori di ESBL. Gli studi hanno dimostrato che la prevalenza di ESBL varia da paese a paese e da istituzione a istituzione sia negli isolati nosocomiali che in quelli comunitari. Questo può essere attribuito alle abitudini di prescrizione degli antibiotici e alla presenza di patogeni che ospitano i geni per la produzione di ESBL. Sebbene non esistano linee guida CLSI per il rilevamento della produzione di β-lattamasi AmpC, abbiamo seguito il test del disco AmpC.13 Nel presente studio, la prevalenza di A. baumannii MDR con produzione di AmpC è stata trovata al 35,6%. Una prevalenza quasi simile di Acinetobacter spp. produttori di AmpC è stata riportata dallo stesso ospedale da Parajuli et al24 Tuttavia, in uno studio indiano, è stato documentato un tasso più elevato (56%) di A. baumannii produttori di AmpC.26

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii (CRAB) è incluso nella priorità 1 (cioè, critico) di un elenco di priorità globale dei batteri resistenti agli antibiotici per guidare la ricerca, la scoperta e lo sviluppo di nuovi farmaci da parte dell’Organizzazione Mondiale della Sanità.27 Sebbene esistano diversi meccanismi di resistenza ai carbapenemi, la produzione dell’enzima carbapenemasi è il meccanismo più efficace.9 L’emergere delle MBL in A. baumannii sta diventando una sfida terapeutica poiché questi enzimi possiedono un’elevata attività idrolitica che porta alla degradazione di cefalosporine e carbapenemi di generazione superiore. Inoltre, i geni MBL mediati da plasmidi si diffondono rapidamente ad altre specie di bacilli gram-negativi.28 Pertanto, il rilevamento rapido della produzione di MBL è necessario per modificare la terapia e avviare un controllo efficace delle infezioni per prevenire la loro diffusione. Nello studio attuale, gli isolati produttori di metallo β-lattamasi (MBL) sono risultati più comuni dei produttori di ESBL e AmpC, dove il 67,7% di A. baumannii MDR erano produttori di MBL. In Nepal, sono stati fatti pochi studi sulla prevalenza di MBL, Shrestha et al29 hanno riportato il 47,2% e Parajuli et al24 il 78,8% di produttori di MBL in Acinetobacter spp. dello stesso ospedale. Nello studio di Dey e Bairy,30 MBL è stato riportato solo nel 21,7% degli Acinetobacter spp. La coesistenza di più geni MBL nei batteri è una situazione allarmante. Poiché i geni MBL sono associati a integroni che possono essere incorporati in trasposoni, che a loro volta possono essere ospitati su plasmidi, dando luogo a un apparato genetico altamente mobile, è probabile che si verifichi l’ulteriore diffusione di questi geni in diversi patogeni. Questo studio ha anche cercato di scoprire gli isolati produttori di KPC, dove il 9,5% di A. baumannii MDR e alcuni di loro erano anche co-produttori dell’enzima MBL. Sebbene non ci fosse un singolo articolo riguardante il rilevamento di KPC in Nepal, Parajuli et al24 hanno recentemente riportato specie di Acinetobacter produttori di KPC da pazienti in terapia intensiva. La maggior parte degli isolati produttori di KPC sono stati riportati da USA, Grecia, Cina, Israele e Colombia.31 Tra le carbapenemasi, la KPC ha un’alta frequenza ed è stata comunemente trovata nella polmonite da Klebsiella.32 Tra gli isolati produttori di β-lattamasi, alcuni di essi erano anche coproduttori di diverse β-lattamasi e gli isolati MDR che producevano due diversi tipi di β-lattamasi mostravano un alto profilo di resistenza. La diffusione di batteri produttori di carbapenemasi in tutto il mondo negli ultimi anni è stata considerata come una grande minaccia per la salute pubblica. Dopo che i cloni resistenti ai carbapenemi sono emersi, lasciando la speranza di trattamento dell’infezione da MDR A. baumannii è l’ultima risorsa di antibiotici potenzialmente tossici come polimixina B e colistina solfato.33

Lo studio mostra l’infezione da MDR A. baumannii sta aumentando ad un tasso allarmante nel nostro ospedale. Ora è diventato molto importante controllare questa situazione prima che prenda una forma mortale. Pertanto, la rapida individuazione dei determinanti di resistenza è necessaria per modificare la terapia e avviare un controllo efficace delle infezioni per prevenirne la diffusione.

Limitazioni

Non abbiamo potuto valutare i fattori di rischio e gli esiti delle infezioni da A. baumannii MDR nei pazienti ospedalizzati a causa della mancanza di dati sufficienti dai pazienti. Inoltre, l’analisi genetica dei fenotipi resistenti e dei meccanismi di resistenza ai farmaci non è stata determinata.

Conclusione

Dal presente studio, è chiaro che le infezioni nei pazienti ospedalizzati dovute a MDR A. baumannii sono comuni. Il tasso di produzione di MBL, ESBL e AmpC tra gli isolati MDR è altamente aumentato e questi batteri possono portare ad un’alta morbilità e mortalità, dato che ci viene lasciata l’unica opzione di trattarli con antibiotici potenzialmente tossici come la colistina solfato e la polimixina B e questo è il problema vessatorio per i pazienti ospedalizzati. Le raccomandazioni stabilite, tra cui un’adeguata rilevazione della resistenza ai farmaci negli agenti patogeni, politiche di restrizione antimicrobica per evitare l’uso eccessivo di antibiotici ad ampio spettro, il miglioramento dei sistemi di sorveglianza della resistenza e rigorose misure di controllo delle infezioni, aiuteranno a controllare questa situazione.