La DNA polimerasi è un enzima biologico vitale che è presente nella replicazione del DNA. Nel processo, il DNA si copia in due molecole di DNA figlie e sintetizza un nuovo filamento di DNA dal filamento esistente aggiungendo dNTP al DNA in crescita.
La DNA polimerasi ha due ruoli cruciali nella replicazione: L’attività di polimerasi da 5′ a 3′ esonucleasica e l’attività di correzione da 3′ a 5′ esonucleasica. Quando la polimerasi si lega al DNA, aggiunge nucleotidi nella direzione da 5′ a 3′.
Purtroppo, poiché si disattiva a una temperatura più alta, la DNA polimerasi non è adatta a un tipo di replicazione chiamato reazione a catena della polimerasi (PCR). La DNA polimerasi Taq, invece, gioca un ruolo essenziale nella PCR.
Che cos’è la Taq polimerasi?
Taq DNA polimerasi è una DNA polimerasi ricombinante altamente termostabile. Prende il nome da Thermus aquaticus, il batterio tollerante al calore da cui si isola. Il peso molecolare della Taq polimerasi è 94kD, e amplifica il DNA fino a 5kb con una velocità di allungamento di 0,9-1,2kb/min a 70-75°C.
Che cos’è la reazione a catena della polimerasi (PCR)?
La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica di replicazione che produce numerose copie di una specifica regione di DNA in vitro (in una provetta piuttosto che in un organismo). La PCR è utilizzata in varie aree della biologia e della medicina, compresa la ricerca in biologia molecolare, la diagnostica medica e l’ecologia.
La PCR si basa sulla Taq Polymerase, una DNA polimerasi termostabile. Richiede anche primer di DNA che sono progettati specificamente per la regione di DNA di interesse, così come DNA modello e nucleotidi (blocchi di costruzione del DNA).
In una reazione PCR, si assemblano gli ingredienti chiave in una provetta, insieme ai cofattori che l’enzima richiede. Gli ingredienti sono sottoposti a ripetuti cicli di riscaldamento e raffreddamento che alla fine sintetizzano il DNA.
Ci sono anche tre passi fondamentali da seguire per ottenere la PCR, tra cui:
- Denaturazione (96 °C): riscaldare fortemente la reazione per separare, o denaturare, i filamenti di DNA.
- Ricottura (55-65 °C): Raffredda la reazione in modo che i primer possano legarsi alle loro sequenze complementari sul DNA modello a singolo filamento.
- Estensione (72 °C): Alzare la temperatura di reazione in modo che la Taq polimerasi estenda i primer, sintetizzando nuovi filamenti di DNA.
Il ciclo si ripete 25-35 volte in una tipica reazione PCR, che generalmente richiede 2-4 ore, a seconda della lunghezza della regione di DNA da copiare. Se la reazione è efficiente, la regione bersaglio può passare da una o poche copie a miliardi.
Il ruolo della Taq polimerasi nella PCR
A causa del suo ruolo chiave nel sintetizzare e amplificare nuovi filamenti di DNA, la Taq DNA polimerasi è essenziale per la reazione a catena della polimerasi (PCR).
Come altre DNA polimerasi, la Taq polimerasi può produrre DNA solo se ha un primer, una breve sequenza di 20 nucleotidi che fornisce un punto di partenza per la sintesi del DNA. Tuttavia, è anche una DNA polimerasi termostabile che può lavorare a temperature più elevate.
Taq DNA polimerasi è altamente efficiente, quindi diventa pienamente funzionale quando raggiunge la sua temperatura ottimale. Ha anche un’emivita di più di due ore (a una temperatura di 92 °C), un’alta capacità di amplificazione e la capacità di aggiungere 150 nucleotidi al secondo.
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