1 Teoria
Gli oligonucleotidi sono sintetizzati dall’aggiunta di una base alla volta, che si estende dalla 3′ alla 5′ estremità, attaccata a un supporto in fase solida. Quando la sintesi chimica dell’oligonucleotide è completa, la catena di DNA viene rilasciata dal supporto solido mediante incubazione con idrossido di ammonio. L’ammonio agisce anche come agente deprotettivo, eliminando i gruppi che proteggono i fosfati nei legami fosfodiesteri. Dopo questo, l’ammoniaca calda viene aggiunta per idrolizzare i gruppi di protezione dai gruppi amminici esociclici della deossiadenosina, deossicitosina e deossiguanosina. L’oligonucleotide potrebbe essere fornito all’utente nella soluzione di ammoniaca come preparazione grezza. In questo caso, prima dell’uso, può essere necessario effettuare un ulteriore passaggio per rimuovere i sali e i sottoprodotti dalla preparazione dell’oligonucleotide generati durante la deprotezione.
Dopo la deprotezione, la preparazione dell’oligonucleotide viene solitamente dissalata, quantificata, evaporata a secco in un liofilizzatore e fornita all’utente in forma di polvere. La soluzione desalinizzata dell’oligonucleotide contiene l’oligonucleotide completo, ma contiene anche una miscela di prodotti troncati che sono stati accumulati durante la sintesi chimica. Il troncamento avviene quando la base specificata non riesce ad aggiungersi alla catena nel ciclo corrispondente (Hecker & Rill, 1998). Quindi, la percentuale di prodotti troncati accumulati nella preparazione è determinata dall’efficienza di sintesi (la frazione di prodotto completo dopo la sintesi) e dalla lunghezza della molecola. Gli oligonucleotidi lunghi, che richiedono più cicli per essere sintetizzati, sono meno puri degli oligonucleotidi corti. Queste mancanze possono competere con il prodotto completo in alcune applicazioni e possono richiedere la rimozione prima che l’oligonucleotide possa essere utilizzato. Tuttavia, le preparazioni di oligonucleotidi desalinizzati sono solitamente adatte a molte applicazioni, come la PCR standard o i microarray, specialmente se l’oligonucleotide è < lungo 20 nucleotidi.
Si raccomanda un’ulteriore purificazione per oligonucleotidi più lunghi di 50 basi perché la percentuale di prodotto full-length nella preparazione non è tipicamente superiore all’80%. Per applicazioni impegnative in cui la lunghezza esatta dell’oligonucleotide è importante, come i saggi gel-shift, la mutagenesi sito-diretta, il sequenziamento, la produzione di adattatori di clonazione o la sintesi di cDNA first-strand per la generazione di librerie, si raccomanda un’ulteriore purificazione, anche per gli oligonucleotidi più corti (vedere maggiori informazioni sulle tecniche sopra riportate su Saggi standard in vitro per le interazioni proteine-acido nucleico – Saggi gel shift per il legame di RNA e DNA e mutagenesi sito-diretta).
La purificazione può essere richiesta dopo la sintesi o dopo la modifica enzimatica dell’oligonucleotide. Ci sono diversi metodi per ottenere questo risultato, e la scelta dipende dalla natura dell’oligonucleotide e dall’applicazione a cui è destinato.
La purificazione HPLC in fase inversa si basa sull’idrofobicità. Utilizza una fase stazionaria non polare e tamponi acquosi e solventi organici come fase mobile per eluire gli analiti; i composti polari vengono eluiti per primi, mentre quelli non polari vengono trattenuti. Questo è il metodo migliore per purificare gli oligonucleotidi modificati con un gruppo idrofobico, come la biotina, le etichette di coloranti fluorescenti o le coniugazioni NHS-estere. Il recupero della massa è maggiore rispetto alla purificazione con PAGE ed è adatto alla purificazione di quantità maggiori di oligonucleotidi (scala mmole), anche se non rimuove i prodotti incompleti in modo così efficace. Le cartucce per la purificazione degli oligonucleotidi, basate sulla cromatografia a fase inversa, forniscono un metodo veloce per desalinizzare e purificare gli oligonucleotidi.
L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) risolve gli oligonucleotidi in base alla loro lunghezza e quindi offre una risoluzione sufficiente per differenziare i prodotti a lunghezza intera dalle molecole fallate (Atkinson e Smith, 1984). I gel di poliacrilammide sono più efficaci per separare piccoli frammenti di DNA rispetto ai gel di agarosio (vedi Analisi dell’RNA mediante elettroforesi analitica su gel di poliacrilammide ed elettroforesi su gel di agarosio). L’unico svantaggio dei gel di poliacrilammide è che sono più difficili da preparare e gestire rispetto ai gel di agarosio. I gel di poliacrilammide sono eseguiti in una configurazione verticale in un campo elettrico costante. Dopo l’elettroforesi, l’oligonucleotide viene eluito dal gel e concentrato, utilizzando la precipitazione con etanolo (per saperne di più sulla precipitazione degli acidi nucleici su Purificazione dell’RNA – metodi di precipitazione) o la cromatografia a fase inversa. Questo è il metodo di scelta quando si desidera la più alta percentuale di oligonucleotidi full-length per applicazioni impegnative. È anche fortemente raccomandato per gli oligonucleotidi più lunghi di 30 basi. Inoltre, diversi campioni possono essere eseguiti simultaneamente e non sono necessarie attrezzature costose. L’unico svantaggio di questa tecnica è la piccola quantità di oligonucleotide ottenuta per purificazione. In genere, gli oligonucleotidi sono utilizzati nella scala di 1 μmol o meno, e il recupero della massa dopo la purificazione PAGE è < del 50% e anche inferiore nel caso di oligonucleotidi modificati. Tuttavia, anche se la resa è bassa, è soddisfacente per la maggior parte delle applicazioni biochimiche.
La preparazione dell’oligonucleotide viene caricata su un gel di poliacrilammide denaturante ad una quantità di almeno 1 mg per corsia. La gamma di risoluzione del gel dipende dalla concentrazione di poliacrilammide. Per gli oligonucleotidi corti (da 15 a 35 basi), si raccomandano gel di poliacrilammide al 13-15%; per gli oligonucleotidi più lunghi (da 35 a 70 basi), si raccomandano gel di poliacrilammide all’8-13%. La percentuale del gel dovrebbe essere adattata al sistema di esecuzione. Di solito usiamo il sistema Bio-Rad Mini Protean II ed eseguiamo gel al 15% per purificare oligonucleotidi di 25 basi di lunghezza. Dopo l’identificazione della banda corretta mediante visualizzazione UV, la banda viene eliminata ed estratta dal gel.
In questo capitolo vengono descritti due diversi metodi di purificazione degli oligonucleotidi dai gel di poliacrilammide. Il metodo più semplice è l’eluizione per diffusione. Questo si basa sul movimento delle molecole da una regione di maggiore concentrazione a una di minore concentrazione. Il risultato della diffusione è una graduale miscelazione del materiale. Questo metodo è dispendioso in termini di tempo, ma non richiede troppo lavoro né alcuna attrezzatura. Fondamentalmente, la banda di poliacrilammide contenente l’oligonucleotide di interesse viene tagliata in piccoli pezzi e coperta con il tampone di eluizione. Dopo l’incubazione, il DNA viene purificato dal surnatante mediante precipitazione con etanolo. La resa è limitata, tra il 20% e il 70%, a seconda della lunghezza dell’oligonucleotide. Maggiore è la quantità di buffer di eluizione utilizzato, maggiore è la diffusione dell’oligonucleotide dal gel.
Il secondo metodo è l’elettroeluizione in un sacchetto da dialisi (McDonell et al., 1977). Il pezzo di gel contenente l’oligonucleotide viene rimosso e messo in un sacchetto di dialisi con un tampone. L’applicazione di una corrente elettrica provoca la migrazione del DNA dal gel al tampone del sacchetto di dialisi. L’oligonucleotide viene recuperato da questo buffer e purificato. Usando questo metodo, l’oligonucleotide può essere isolato con una buona resa, anche se richiede tempo se si purifica un gran numero di campioni allo stesso tempo, perché richiede l’inserimento di ogni banda del gel in sacchetti di dialisi individuali. Questo metodo funziona bene anche per frammenti di DNA più grandi e può anche essere usato per estrarre il DNA da gel di agarosio.