Sottogruppi distinti di fibroblasti regolano l’integrità lattiginosa attraverso il VEGF-C indotto da YAP/TAZ nei villi intestinali

Animali da esperimento

Tutte le procedure di cura e sperimentazione degli animali erano conformi a tutte le norme etiche per la ricerca e sperimentazione animale sotto l’approvazione dell’Institutional Animal Care and Use Committee (No. KA2016-12) del Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 e Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 topi sono stati trasferiti, stabiliti e allevati in strutture per animali privi di patogeni specifici (SPF) al KAIST. I topi C57BL/6 J, R26-tdTomato e Myh11-Cre-ERT2 sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. Tutti i topi sono stati mantenuti nel background C57BL/6 e alimentati con libero accesso a una dieta standard (PMI LabDiet) e acqua. Al fine di indurre l’attività Cre nei topi Cre-ERT2, 2 mg di tamoxifene (Sigma-Aldrich) sciolto in olio di mais (Sigma-Aldrich) è stato iniettato per via intraperitoneale (i.p.) ai punti di tempo indicati per ogni esperimento. Cre-ERT2 negativo ma flox/flox-positivo tra i topi della cucciolata sono stati definiti come controllo (WT) topi per ogni esperimento. I topi sono stati anestetizzati con iniezione i.p. di una combinazione di anestetici (80 mg/kg di ketamina e 12 mg/kg di xilazina) prima di essere sacrificati.

Analisi istologiche

Per la colorazione whole-mount dell’intestino tenue, la perfusione transcardiale è stata eseguita con paraformaldeide 2% (PFA) dopo l’anestesia. L’intestino tenue è stato raccolto e tagliato longitudinalmente per esporre il lume. Dopo diversi lavaggi con PBS, gli intestini sono stati appuntati su piastre di silicio. I campioni sono stati poi post-fissati a 4 ° C in 4% PFA per 2 ore. I campioni sono stati lavati con PBS più volte e sono stati successivamente disidratati con saccarosio al 10% in PBS per 2 ore e con saccarosio 20%, 10% glicerolo in PBS durante la notte. Pelle dell’orecchio, trachea e diaframma sono stati raccolti senza perfusione transcardiale e fissati in 4% PFA per 1 h a 4 ° C. I campioni sono stati lavati con PBS più volte prima del blocco. Dopo il blocco con 5% di siero di capra o di asino in 0,5% Triton-X 100 in PBS (PBST) per 1 ora, i campioni sono stati incubati con gli anticorpi primari indicati diluiti nella soluzione di blocco a 4 ° C durante la notte. Dopo diversi lavaggi con PBST, i campioni sono stati incubati per 2 ore a temperatura ambiente (RT) con gli anticorpi secondari coniugati al fluorocromo indicati diluiti nel tampone di bloccaggio. I campioni sono stati lavati con PBST e i nuclei sono stati colorati con DAPI (Invitrogen). Dopo il lavaggio con PBS, i campioni sono stati montati con Vecta-shield (Vector Laboratories). Le immagini sono state ottenute utilizzando il microscopio confocale Zeiss LSM 800 o LSM 880 (Carl Zeiss).

Nell’immunocolorazione sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari e secondari: anti-LYVE-1 (coniglio policlonale, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (monoclonale di ratto, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (monoclonale di criceto, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-caderina (policlonale di capra, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (policlonale di capra, AF2727, R&D, 1:400); anti-Prox1 (coniglio policlonale, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anti-VE-caderina (capra policlonale, AF1002, R&D, 1:200); anti-PDGFRβ (monoclonale di ratto, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (monoclonale di topo, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (policlonale di capra, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (monoclonale di coniglio, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (coniglio policlonale, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (coniglio policlonale, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (coniglio policlonale, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (policlonale di capra, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (policlonale di coniglio, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (policlonale di capra, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (monoclonale di coniglio, 14074, Cell signaling, 1:200); anti-TAZ (policlonale di coniglio, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-αSMA, coniugato con fluoresceina isotiocianato (FITC) (monoclonale di topo, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (policlonale di capra, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (policlonale di capra, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (monoclonale di coniglio, 13179, Cell signaling, 1:400); anti-F4/80, coniugato FITC (monoclonale di ratto, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (monoclonale di criceto, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmina (policlonale di coniglio, AB907, Millipore, 1:400); e Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647- anticorpi secondari coniugati anti-rabbit, anti-ratto, anti- capra, anti-criceto (diluiti in un rapporto di 1:1000) sono stati acquistati da Jackson ImmunoResearch. Tutti gli anticorpi utilizzati nel nostro studio sono stati convalidati per le specie e le applicazioni.

Ibridizzazione in situ a fluorescenza di singole molecole (smFISH)

Per smFISH di intestino tenue, perfusione transcardiale è stata eseguita con 2% PFA dopo l’anestesia. I campioni sono stati post-fissati a 4 ° C in 4% PFA per 2 ore. I campioni sono stati lavati con PBS più volte, trasferiti al 30% di saccarosio, e incubati durante la notte. I campioni incorporati in OCT sono stati sezionati, e abbiamo eseguito il smFISH secondo il protocollo del produttore che è descritto nel kit RNAscope Fluorescent Multiplex Assay (320850, ACDBio). La sonda RNA scope (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) è stata usata per lo smFISH. I seguenti anticorpi primari e secondari sono stati utilizzati nell’immunocolorazione con smFISH: anti-PDGFRβ (monoclonale di ratto, ab91066, Abcam); anti-Shisa3 (policlonale di coniglio, TA320118, Origene); anti-P2X1 (policlonale di coniglio, APR-001, Alomone labs) e anticorpi secondari coniugati Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647 sono stati acquistati da Jackson ImmunoResearch. Le immagini sono state ottenute utilizzando il microscopio confocale Zeiss LSM 800 o LSM 880 (Carl Zeiss).

Saggio di incorporazione EdU per la proliferazione delle LEC

Per rilevare la proliferazione delle LEC in lattiera, 5 mg di 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU, A10044, Invitrogen) è stato sciolto in 1 ml di acqua Milli-Q come soluzione stock. Poi, 200 μl della soluzione stock per topi è stato iniettato i.p. ogni due giorni per una settimana prima dell’analisi. Intestino tenue è stato isolato e trattati come descritto sopra. EdU-incorporato cellule sono state rilevate con il Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore.

Microscopia elettronica

Per catturare immagini al microscopio elettronico ultrastruttura di lacteal, intestino tenue è stato sezionato dopo perfusione transcardiale con 4% PFA e 0,25% glutaraldeide in 0,1 M tampone fosfato (pH 7,4). I campioni sono stati poi fissati per una notte in 2,5% glutaraldeide, post-fissato con 1% tetrossido di osmio, e disidratato con una serie di concentrazioni crescenti di etanolo seguita da resina embedding. 70-nm sezioni ultrasottili lacteal sono stati ottenuti utilizzando un ultramicrotomo (UltraCut-UCT, Leica), che sono stati poi raccolti su griglie di rame. I campioni sono stati ripresi con trasmissione EM (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) a 120 kV dopo la colorazione con il 2% di acetato di uranile e citrato di piombo.

Immagini intravitali di liquidazione dei lipidi dalla lamina propria

I topi sono stati anestetizzati dopo la rimozione del cibo per 12 h prima della procedura. Imaging intravitale è stata eseguita come abbiamo precedentemente descritto34. Brevemente, BODIPY sonde lipidiche (0,1 mg / ml, Thermo Fisher) sono stati sciolti in 2,5% soluzione DMSO (Sigma-Aldrich). Anti-LYVE-1 (ratto monoclonale, 223322, R&D) coniugato con Alexa Fluor 647 (Invitrogen) anticorpo (0,75 mg / kg) è stato iniettato per via endovenosa a 12 h prima dell’imaging per etichettatura fluorescente di lacteals. Poi, il digiuno prossimale è stato esteriorizzato in una camera di imaging dove la temperatura è stata mantenuta a 37 ° C durante l’imaging. Dopo l’apertura chirurgica del lume intestinale 1,5 cm lungo il confine anti-mesenterico, un vetro di copertura è stato posto sul lume esposto per ottenere una vista villi. L’imaging intravitale è stato fatto in tre sessioni. I villi sono stati prima imaged prima della fornitura BODIPY-FA a 0 min. Poi, 30 microlitri di BODIPY sonde lipidiche sono stati forniti una volta prima della seconda sessione di imaging per osservare l’assorbimento iniziale BODIPY lipidi a 1 min. Successivamente, i lipidi BODIPY sono stati forniti tre volte con intervalli di 2 minuti prima della terza sessione di imaging a 26 min, e BODIPY-FA clearing attraverso i lattosio è stato analizzato a 36 min e 46 min. Un home-built video-rate laser-scansione microscopio confocale è stato utilizzato34. Due laser ad onda continua che emettono a 488 nm (MLD, Coherent) e 640 nm (Cube, Coherent) sono stati utilizzati come fonti di eccitazione per l’imaging di fluorescenza. Due filtri passa-banda (FF01-525/50 e FF01-685/40, Semrock) sono stati utilizzati per il rilevamento di segnali fluorescenti. La risoluzione assiale inferiore a 4 μm è stata acquisita con un pinhole da 100 μm e un obiettivo 60x (LUMFLN, immersione in acqua, NA 1.1, Olympus). Le immagini (512 × 512 pixel) sono state ottenute ad un frame rate di 30 Hz. Per il miglioramento del rapporto segnale-rumore dell’immagine, il rumore su 90 fotogrammi dopo la post-elaborazione delle immagini in tempo reale (30 fotogrammi / sec) sono stati mediati rimuovendo l’artefatto di movimento generato dalla peristalsi con un programma MATLAB scritto su misura. Il software ImageJ (NIH) è stato utilizzato per misurare l’intensità fluorescente media nella lamina propria.

Test di assorbimento dei lipidi

Dopo la rimozione del cibo per 12 h, 200 μl di olio d’oliva (Sigma-Aldrich) sono stati somministrati per via orale per la misurazione dei trigliceridi plasmatici e la colorazione Oil Red O. Il sangue è stato campionato attraverso la vena della coda nel tubo di raccolta del sangue contenente eparina a 0, 1, 2, 3, e 4 ore dopo la somministrazione di olio d’oliva. La concentrazione di trigliceridi nel plasma è stata misurata utilizzando un analizzatore VetTest Chemistry (IDEXX Lab). L’intestino tenue è stato colorato con Oil red O a 12 h dopo la somministrazione di olio d’oliva seguendo il protocollo del produttore del kit di colorazione Oil Red O (MAK194, Sigma-Aldrich). Dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) (60% kcal di grassi, Research Diets, D12492) l’alimentazione è iniziata a 12 settimane e continuato per 8 settimane per la misurazione dei trigliceridi plasmatici e Oil Red O colorazione. Il sangue è stato campionato attraverso la vena della coda nel tubo di raccolta del sangue contenente eparina dopo 6 ore di digiuno. Per la colorazione Oil red O delle sezioni di fegato, il fegato raccolto, fissato in 4% PFA per una notte a 4 ° C, sono stati tagliati in sezioni vibratome 100 μm (Leica, VT1200S), sono stati colorati con Oil red O.

Trasduzione di AAV

I topi indicati hanno ricevuto una singola dose i.p. (1012 particelle virali in 150-200 µl) di un AAV ricombinante che codifica i domini leganti il ligando 1-4 del VEGFR3 fusi al dominio IgG Fc (AAV-mVEGFR31-4-Ig), e topi di controllo hanno ricevuto la stessa dose di AAV che codifica i domini 4-7 del VEGFR3, che non legano VEGF-C o VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), fusi al dominio IgG Fc, come precedentemente descritto37. AAV-mVEGFR31-4-Ig e AAV-mVEGFR34-7-Ig sono stati rilevati nel siero mediante analisi immunoblotting (anticorpo anti-VEGFR3; capra policlonale, AF743, R&D) di 0.5 μl di campioni di siero raccolti lo stesso giorno dell’analisi intestinale.

Trattamento dell’anticorpo

Per il blocco di VEGFR2, abbiamo usato un anticorpo neutralizzante VEGFR2 (DC101). Una linea cellulare di ibridoma che produce DC101 è stata acquistata dalla American Type Culture Collection (ATCC). Le cellule dell’ibridoma sono state coltivate in un terreno privo di siero. Le proteine ricombinanti nei surnatanti sono state purificate mediante cromatografia su colonna con gel di agarosio Protein A (Oncogene). Dopo la purificazione, le proteine ricombinanti sono state quantificate utilizzando il saggio Bradford e confermate dalla colorazione blu Coomassie dopo l’elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato (SDS) – poliacrilammide (PAGE). DC101 (50 mg/kg) o una quantità uguale di anticorpo di controllo (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) è stato iniettato i.p. nei topi indicati ogni 2 giorni per 2 settimane. Dopo aver aperto longitudinalmente i frammenti dell’intestino e averli lavati con PBS, i campioni sono stati tagliati in pezzi da 2 cm e le placche di Peyer sono state rimosse. I campioni sono stati lavati con PBS e incubati con 10 mM EDTA con DMEM senza calcio e magnesio (Gibco) in ghiaccio per 20 minuti. I tessuti sono stati vortexati con PBS senza calcio fino ad ottenere un surnatante chiaro che era privo di cellule epiteliali. Pezzi di campione sono stati tagliati ulteriormente in frammenti di 1 mm e dissociato con tampone dissociazione contenente 2 mg / ml collagenasi II (Worthington), 1 mg / ml Dispase (Gibco), e 1 U / ml DNase (Invitrogen) in DMEM a 37 ° C per 30 min. Per aiutare la dissociazione, i pezzi di tessuto sono stati delicatamente pipettati su e giù ogni 10 min. I campioni sono stati poi filtrati attraverso un filtro da 70 μm per disaggregare meccanicamente i frammenti intestinali rimanenti. Dopo aver raccolto i surnatanti, è stato aggiunto un volume uguale di DMEM contenente 10% di siero fetale bovino (FBS). Dopo la centrifugazione, le cellule sono state risospese in PBS. Per arricchire la frazione di cellule stromali e LECs, le cellule ematopoietiche e le cellule epiteliali sono stati esauriti utilizzando AutoMACS (Miltenyi) dopo l’incubazione per 15 minuti in ghiaccio con anti-CD45 e anti-CD326 Microbeads (Miltenyi). Per l’isolamento IntSC, anti-CD31 Microbeads (Miltenyi) sono stati aggiunti per esaurire le cellule endoteliali in aggiunta al anti-CD45 e anti-CD326 Microbeads.

Cultura primaria di mouse IntSCs

Dopo l’isolamento di IntSCs, le cellule sono state coltivate con DMEM/F12 contenente 10% FBS su una piastra di coltura di tessuti per 24 h o 2 giorni. Per i trattamenti farmacologici e la colorazione di immunofluorescenza, 50.000 cellule per pozzetto sono state piastrate su 4 pozzetti Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich). Le concentrazioni dei farmaci sono descritte nelle legende delle figure indicate e i trattamenti sono durati 6 ore per l’immunofluorescenza e l’analisi dell’espressione genica. Un piatto di imaging 35-mm con una superficie elasticamente supportato (Ibidi) è stato utilizzato per la cultura IntSC su morbido (1.5 kPa) e rigido (28 kPa) matrici per 24 h. Per l’induzione di attività cre in coltura primaria IntSCs derivati da WT o Yap / Tazi∆FRC topi, le cellule sono state trattate con 5 µM di 4-idrossi-tamoxifene (4-OHT) in 100% etanolo (EtOH) o 100% EtOH solo per 2 giorni come controllo. Per gli esperimenti sono stati utilizzati monostrati di IntSCs che sono stati convalidati come PDGFRβ+.

Citometria a flusso e selezione cellulare

Per ordinare PDGFRβ+ IntSCs o LECs intestinali, le frazioni arricchite sono andate in lisi RBC per sospensione in tampone di lisi ACK (Gibco) per 5 min a RT. Dopo aver bloccato i recettori Fcγ con mouse anti-CD16/CD32 (553141, BD Bioscience), le cellule sono state incubate per 15 min con anticorpi indicati in FACS buffer (2% FBS in PBS). Dopo diversi lavaggi, le cellule sono state analizzate con FACS Canto II (BD Biosciences) e i dati acquisiti sono stati ulteriormente valutati utilizzando il software FlowJo (Treestar). L’ordinamento delle cellule è stato eseguito con FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Le cellule morte sono state escluse usando la colorazione DAPI (Sigma-Aldrich) e i doppietti di cellule sono stati sistematicamente esclusi. L’intensità di fluorescenza è espressa in unità arbitrarie su una scala logaritmica, e la dispersione in avanti e la dispersione laterale sono rappresentate su una scala lineare. I seguenti anticorpi sono stati utilizzati per la citometria a flusso: FITC anti-mouse CD45 (11-0451-85, monoclonale di ratto, Biolegend); FITC anti-mouse TER-119 (11-5921-85, monoclonale di ratto, Biolegend); APC anti-mouse CD31 (551262, monoclonale di ratto, BD Bioscience); e PE/Cy7 anti-mouse Podoplanin (127412, monoclonale di criceto siriano, Biolegend).

Bulk RNA-sequencing

Bulk RNA-sequencing dei PDGFRβ+ IntSCs isolati è stato eseguito ottenendo il file di allineamento. Brevemente, le letture sono state mappate utilizzando lo strumento software TopHat. Il file di allineamento è stato utilizzato per assemblare le trascrizioni, stimare le loro abbondanze, e rilevare l’espressione differenziale dei geni o isoforme utilizzando gemelli. Lo strumento Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) è stato utilizzato per valutare ulteriormente i dati nel contesto della segnalazione canonica e determinare se i geni YAP/TAZ-iperattivati erano specificamente legati alle molecole secretorie. La significatività della segnalazione canonica è stata testata con la procedura Benjamini-Hochberg, che regola il valore P per correggere i confronti multipli, e la loro attivazione o inibizione è stata determinata con riferimento agli z-scores di attivazione. L’analisi dei cluster e le heatmap sono state generate utilizzando Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). Per GSEA, collezioni di set di geni dal Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/) sono stati utilizzati.

MEFs e HDLECs

Fibroblasti embrionali di topo (MEFs) sono stati isolati da embrioni E12.5 come precedentemente descritto32. Brevemente, testa, arti e tessuti del cuore sono stati rimossi e campioni sono stati tritati con le forbici e digerito con 0,1% tripsina / EDTA con DNase (1 U / ml, Invitrogen) a 37 ° C per 20 min. Dopo la digestione e la rimozione dei tessuti non digeriti, le cellule sono state filate brevemente, placcato su un piatto 10 cm, e ha permesso di crescere a subconfluenza. MEF sono stati poi mantenuti in DMEM/F12 contenente 10% FBS. Cellule endoteliali dermiche umane linfatiche (HDLECs) sono stati acquistati da Lonza e coltivate in mezzo di crescita endoteliale (EGM2-MV, Lonza). MEFs e HDLECs sono stati utilizzati al passaggio 2 o 3. Le cellule sono state incubate in un’atmosfera umidificata del 5% di CO2 a 37 ° C e confermato di essere micoplasma-negativo (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Sferoide-based sprouting test

Sferoidi LEC sono stati generati dalla coltura HDLEC al passaggio 2 o 3 in terreno di coltura contenente 0,25% metilcellulosa e incubazione durante la notte come gocce appese36. Gli sferoidi sono stati poi raccolti e incorporato in 2 mg/ml collagene tipo I (Corning), trattati con controllo sieroalbumina bovina (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) o ANGPT2 (5 μg/ml, generato in casa) con o senza VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) in Endothelial Cell Basal Medium (PromoCell) contenente 1% FBS per 24 h. Alla fine dell’incubazione, lo sferoide è stato colorato con cell tracker (Molecular Probes, 1.5 μM, 37 °C, 30 min). Gli sferoidi sono stati poi fissati in 4% PFA per 15 min a RT e fotografati usando Cell observer (Carl Zeiss).

Quantitative RT-PCR

RNA è stato estratto usando RNeasy Micro kit (Qiagen) o Trizol RNA extraction kit (Invitrogen). Un totale di 1 µg di RNA estratto è stato trascritto in cDNA utilizzando GoScript Reverse Transcription Kit (Promega). La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando FastStart SYBR Green Master mix (Roche) e il termociclatore S1000 (Bio-Rad) con i primer indicati. I primer sono stati progettati utilizzando Primer-BLAST o adottati da studi precedentemente pubblicati, che sono descritti nella tabella supplementare 1. Gapdh è stato usato come gene di riferimento e i risultati sono stati presentati come espressioni relative al controllo. La specificità della reazione dei primer è stata confermata dall’analisi della curva di fusione. Espressione genica relativa è stata analizzata con il metodo ΔΔCt utilizzando il software CFX Manager (Bio-Rad).

In vitro tratto e gli esperimenti osmotici

MEFs e IntSCs primario del mouse sono stati allungati utilizzando uno strumento meccanico di stretching delle cellule (STREX) con un 4% di tratto lineare a 10 cicli/min, e lo stress osmotico è stato applicato con 0,4 M sorbitolo per 3 ore come precedentemente descritto40,50. Le cellule sono state tenute in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C durante tutti gli esperimenti.

Esperimenti osmotici ex vivo

Dopo aver aperto la cavità addominale sotto anestesia, la parte di digiuno dell’intestino tenue è stata tagliata in pezzi da 2 cm. I frammenti di intestino sono stati aperti longitudinalmente e lavati con PBS. I tessuti sono stati poi coltivati in DMEM/F12 con 5% FBS e lo stress osmotico è stato applicato immediatamente con 0,4 M sorbitolo nel mezzo di coltura per 3 ore. I tessuti sono stati tenuti in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C durante tutti gli esperimenti.

Macchiatura in immunofluorescenza dei MEF

I MEF sono stati piastrati su vetrini da 8 pozzetti Nunc Lab-Tek II (Sigma-Aldrich) e fissati con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a 4 °C. Dopo diversi lavaggi con PBS, i campioni sono stati bloccati con 5% di siero di capra (o asino) in 0,5% PBST per 30 min a RT. Le cellule sono state incubate con gli anticorpi primari indicati a 4 °C durante la notte. Gli anticorpi primari legati sono stati rilevati mediante incubazione con anticorpi secondari per 90 minuti a RT. I seguenti anticorpi primari sono stati utilizzati per la colorazione delle cellule: anti-YAP (coniglio monoclonale, 14074, Cell signaling); anti-TAZ (coniglio policlonale, HPA007415, Sigma-Aldrich); e Alexa Fluor 488 coniugato anti-phalloidin (A12379, Thermo Fisher) anticorpi. Gli anticorpi secondari coniugati Alexa Fluor 594 sono stati acquistati da Jackson ImmunoResearch. I nuclei sono stati colorati con DAPI (Invitrogen) e i vetrini sono stati montati e fotografati come descritto sopra.

ChIP-qPCR

LeMEF sono state fissate con 1% PFA per 10 min e quenched con glicina. I campioni sono stati lavati con PBS e lisati con tampone di lisi contenente 1% SDS. Il DNA fissato nei lisati cellulari è stato sonicato con l’utilizzo del Focused-ultrasonicator (Covaris). I lisati cellulari sono stati centrifugati, e tutti tranne il 5% (salvato per il controllo di ingresso lisato di cellule intere) dei surnatanti risultanti sono stati diluiti con tampone di diluizione ChIP contenente 0,5% Triton X-100. I campioni diluiti sono stati poi incubati per una notte a 4 ° C con anticorpo anti-TEAD4 (monoclonale del mouse, ab58310, Abcam). Poi, la proteina A/G Dynabeads (Thermo Fisher) è stata aggiunta e i campioni sono stati incubati per 2 ore a 4 °C. Le perline sono state isolate con DynaMag-2 (Thermo Fisher), lavate con una serie di tamponi di lavaggio ChIP: tampone di lavaggio a basso sale, tampone di lavaggio ad alto sale, tampone di lavaggio LiCl e tampone TE. I campioni sono stati eluiti in 1% SDS due volte per 15 minuti ciascuno a 65 °C. Le perle sono state rimosse e sia il materiale eluito e il 5% dei campioni di input lisato cellulare intero sono stati invertiti-cross-linked durante la notte a 65 ° C. Dopo aver normalizzato il pH, i campioni sono stati incubati per 30 min con RNasi (3 μg/mL) a 37 °C e per 2 ore con proteinasi K (20 mg/ml) e glicogeno (20 mg/ml) a 55 °C. Il DNA è stato eluito utilizzando procedure standard e ChIP-DNA sono stati analizzati da qPCR rispetto ai campioni di input utilizzando i primer elencati nella tabella supplementare 2.

ELISA

Supernatante di primario IntSCs del mouse coltivati sono stati raccolti dopo lo stretching, e supernatante è stato centrifugazione per 15 min. La concentrazione di VEGF-C nel surnatante è stata misurata mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) con il kit ELISA specifico per VEGF-C del topo (CSB-E07361m, Cusabio).

Analisi morfometrica

Le misure morfometriche sono state eseguite utilizzando il software ImageJ (NIH), il software ZEN 2012 (Carl Zeiss), o Imaris (Bitplane). Per la quantificazione della superficie lacrimale, è stata impostata una soglia per le immagini da analizzare e l’area assoluta del villo LYVE-1+ è stata misurata per ogni lacrima all’interno del villo. La lunghezza assoluta dei latti, la lunghezza assoluta dei villi e la larghezza assoluta dei villi sono state misurate utilizzando le immagini dell’immunostaining dei villi E-caderina+ o CD31+ o LYVE-1+ in ogni campo casuale di 850 µm2 della parte indicata dell’intestino. Per le quantificazioni della superficie lattiginosa e dei villi, della lunghezza e della larghezza, sono stati analizzati almeno 100 villi lungo tutto l’intestino tenue. La quantificazione dei seguenti parametri nell’intestino tenue è stata eseguita nel digiuno. Numero di germogli lattiginosi e numero di ramificazioni lattiginose sono stati misurati in 10-20 lattiginosi LYVE-1+ casuali. Numero di Prox1 + LEC e il numero di Prox1 + EdU + LEC sono stati contati manualmente entro 100 micron di lunghezza di 10-20 casuale LYVE-1 + lacteal. Quantificazione di VE-caderina + giunzioni di lacteal è stata eseguita con obiettivo ×40 in lacteal di 5-10 villi per mouse. Brevemente, zipper-tipo giunzione è stato definito come giunzioni continue ai confini cellula-cellula con le cellule che hanno forma allungata51. Button-come giunzione è stato definito come giunzioni discontinue che non sono parallele con i bordi delle cellule-cellule e la foglia di quercia-come forma delle cellule. Le giunzioni che non corrispondono a nessuno dei due modelli sono state classificate come tipo misto. L’intensità di fluorescenza (FI) del BODIPY e la sua quantificazione è stata eseguita come precedentemente descritto34. Olio rosso O area è stata misurata come olio rosso O + area diviso per area villo e normalizzato dalla media di quelli di topi di controllo. L’area di copertura delle cellule muscolari lisce del villo è stata misurata come area di copertura assoluta αSMA+ in cinque campi di 850 µm2 per campione, che è stata poi normalizzata dalla media di quelli dei topi di controllo. Per quantificare le espressioni relative del VEGFR3 lattiginoso, la media FI misurata in cinque campi da 425 µm2 per campione è stata presentata come valori relativi divisi dal suo controllo. Per determinare la densità dei vasi sanguigni, l’area di VEGFR2 è stata misurata in cinque campi da 425 µm2 per campione ed è stata presentata come valori relativi al suo controllo. L’area delle cellule T CD3+ o dei macrofagi F4/80+ è stata misurata in cinque campi da 425 µm2 per campione. La densità dei vasi linfatici è stata calcolata misurando l’area LYVE-1+ in cinque campi casuali da 425-850 µm2 da campioni interi e presentata come valori relativi al suo controllo.

Sequenziamento dell’RNA di singole cellule basato su gocce

Le singole cellule selezionate sono state elaborate utilizzando il kit di reagenti 10X Chromium Single cell 3′ v3 (10X genomics) seguendo i protocolli del produttore. In breve, le cellule selezionate sono state risospese in PBS con 0,5% BSA e mescolate con il mix di reagenti RT e il primer RT, che sono stati poi aggiunti a ciascun canale nei chip 10X, mirando a 5000 cellule. Le cellule sono state separate in Gel Beads in emulsione dove i trascritti di RNA da singole cellule sono stati codificati a barre e invertiti. Dopo la costruzione e l’amplificazione della libreria di cDNA, le molecole di cDNA sono state frammentate enzimaticamente, riparate all’estremità e A-tailed. Dopo aver selezionato la dimensione appropriata delle molecole di cDNA elaborate attraverso una doppia selezione dimensionale utilizzando perline SPRI (Beckman Coulter), sono stati legati con un adattatore, e campione-index PCR è stata eseguita. Dopo un’altra doppia selezione dimensionale utilizzando perline SPRI, i costrutti di libreria finale sono stati diluiti 10 volte e sono stati eseguiti sul Bioanalyzer Agilent High Sensitivity Chip per il controllo di qualità. Librerie di singole cellule sono stati poi sequenziati utilizzando Illumina HiSeq-X piattaforma.

Pre-elaborazione dei dati RNA di singole cellule

I dati di sequenziamento grezzi sono stati prima de-multiplexed e mappato al genoma di riferimento del mouse (mm10) utilizzando Cell Ranger 3.0.2 toolkit da 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Utilizzando R pacchetto Seurat (versione 3.0.0)52, matrici di espressione grezza sono stati costruiti utilizzando Read10X funzione. Le cellule con meno di 1000 geni rilevati o superiore a 6000 geni rilevati (considerati come potenziali doppiette) sono stati esclusi (Fig. 17a supplementare). Inoltre, le cellule con alto gene mitocondriale associato unico identificatore molecolare (UMI) conta (>7% del totale) sono stati considerati come cellule morte e quindi esclusi. Per i geni, quelli espressi da meno di 3 cellule sono stati rimossi. Inoltre, un piccolo numero di cellule immunitarie contaminanti Ptprc + e Pecam1 + Cdh5 + cellule endoteliali sono stati esclusi dopo il primo turno di clustering. Dopo aver rimosso le cellule e i geni indesiderati, i conteggi UMI per ogni gene per una cella sono stati divisi per l’espressione totale di una data cella e moltiplicati per 10.000 e log-trasformati. Poi, i geni sono stati scalati e centrati regredendo variabili come la percentuale di geni mitocondriali e il numero di UMI.

Identificazione dei geni variabili e riduzione della dimensionalità

Pacchetto R Seurat è stato utilizzato per l’analisi di clustering. In primo luogo, i geni altamente variabili nel set di dati sono stati identificati utilizzando la funzione FindVariableFeatures in Seurat con l’opzione: selection.method = “vst”. I primi 2000 geni con la più alta variabilità sono stati selezionati per l’analisi a valle. Utilizzando i geni variabili identificati, sono state effettuate riduzioni di dimensionalità iniziali utilizzando l’analisi delle componenti principali (PCA). La funzione JackStraw è stata utilizzata per determinare la significatività statistica dei punteggi PCA. Le 30 componenti principali (PC) più significative sono state utilizzate come input per l’Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) per ridurre i dati nello spazio bidimensionale.

Analisi del cluster

Al fine di raggruppare le cellule in base ai loro profili trascrizionali, abbiamo eseguito un clustering non supervisionato sui primi 2000 geni altamente variabili per tutti i quattro campioni. Abbiamo prima costruito il grafico SNN (shared nearest neighbors) sullo spazio delle componenti principali usando la funzione FindNeighbors. Poi abbiamo applicato l’algoritmo di Louvain per il clustering basato sull’ottimizzazione della modularità utilizzando la funzione FindClusters. I parametri di risoluzione del clustering sono stati impostati nel punto in cui i cluster hanno mostrato profili trascrizionali altamente distinti. Clusterings erano indipendenti dal numero di geni rilevati per cella (Fig. 17b supplementare). Cluster-specifici marcatori erano geni differenzialmente espressi per ogni cluster identificati attraverso la funzione FindMarkers in Seurat con le seguenti impostazioni: min.pct = 0.3, logfc.threshold = 0.25, min.diff.pct = 0.15, test.use = “MAST”. I marcatori identificati con P < aggiustato 0,05 sono stati utilizzati per ulteriori analisi. Poiché alcuni tipi di cellule come le cellule muscolari lisce e cellule murali avevano marcatori ben noti, la loro apparizione in cima alla lista dei marcatori per ogni cluster ha convalidato i nostri processi di selezione dei marcatori. Per rimuovere la fonte indesiderata di variazioni come il sesso, le cellule sono state divise per presenza femminile trascrizione specifica Xist e integrato. Per eseguire l’integrazione di diversi set di dati, abbiamo prima log normalizzato ogni matrice di espressione grezza e identificato i primi 2000 geni altamente variabili per ogni set di dati. Poi, usando la funzione FindIntegrationAnchors di Seurat, abbiamo identificato le ancore tra i set di dati. Successivamente, i set di dati sono stati integrati sulla base delle ancore identificate tramite la funzione IntegrateData in Seurat. I set di dati integrati sono stati poi scalati e le dimensioni sono state ridotte per ulteriori analisi dei cluster. I cluster nei set di dati integrati sono stati annotati dai loro profili di espressione dei geni nelle liste dei marcatori identificati.

Analisi di arricchimento dell’ontologia genica

L’analisi di arricchimento dell’ontologia genica sui marcatori dei cluster è stata eseguita utilizzando il pacchetto R goseq (versione 1.34.0)53. A seconda della lunghezza del gene, sono state ottenute le ponderazioni per ogni gene e l’approssimazione di Wallenius è stata utilizzata per identificare i termini dell’ontologia genica associati. Sono stati selezionati i termini dell’ontologia genica che hanno P < aggiustato 0,05 e categorie di processi biologici.

Statistica

Nessun metodo statistico è stato usato per predeterminare la dimensione del campione. Gli esperimenti sono stati randomizzati e gli investigatori erano in cieco rispetto all’assegnazione durante gli esperimenti e le analisi dei risultati. Tutti i valori sono presentati come media ± deviazione standard (SD). La significatività statistica è stata determinata dal test Mann-Whitney U a due facce tra due gruppi o dall’ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Holm-Sidak per il confronto tra più gruppi. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.