U.S. Food and Drug Administration

ITG SUBJECT: IROGENI, UN PERICOLO

Introduzione

L’avvento dell’ago ipodermico ha fornito una nuova via di somministrazione dei farmaci. \Ma per i riferimenti di oggi, i primi farmaci parenterali erano rozzi e non sicuri, in quanto l’aumento dell’uso di queste prime soluzioni iniettabili portava con sé infezioni, reazioni avverse ai farmaci, febbri di eziologia sconosciuta e persino morti per shock. Era sconcertante per i primi lavoratori nel campo della microbiologia che febbri sporadiche risultavano dall’iniezione anche delle soluzioni sterili.

Le soluzioni di iniezione moderne sono più sicure, ma la letteratura \2 \ continua a riportare reazioni avverse. In questo numero condividiamo le preoccupazioni per il paziente che non può assumere liquidi per bocca, a causa di un intervento chirurgico o di alcuni tipi di malattia, che potrebbe subire le conseguenze di tossine indesiderate note per essere sostanze che producono febbre, se presenti nel prodotto parenterale. Speriamo di trarre beneficio da ciò che è stato appreso in questo campo.

Storico – Pirogeni

Si sapeva nell’ultima parte del XIX secolo che alcune soluzioni parenterali causavano un aumento marcato della temperatura corporea. Gli agenti che producevano la febbre non erano noti. Le malattie dovute a questa “sostanza febbrile” erano variamente descritte come “febbre da iniezione”, “febbre da acqua distillata” e “febbre salina”, tra gli altri termini. Oggi, i pirogeni batterici sono riconosciuti come l’agente causale responsabile di molte di quelle prime febbri e di molti altri effetti biologici descritti accidentalmente alla terapia parenterale. Da questo possiamo capire perché la massima cura deve essere presa durante la preparazione e l’uso di soluzioni iniettabili per escludere il pirogeno surrettizio.

Difesa naturale e pirogeni

Come esseri umani sani sottoposti a una distribuzione universale di microbi nell’ambiente, coesistiamo con il mondo microbico. Normalmente le difese naturali del corpo limitano i microbi e i loro metaboliti (tossine, ecc.) alle aree in cui possono essere tollerati, come sulla pelle e nel tratto alimentare. La via di somministrazione parenterale di un farmaco permette a un pirogeno, se presente, di aggirare le normali difese del corpo. La risposta dell’ospite è mediata attraverso i leucociti (globuli bianchi) che a loro volta rilasciano il proprio tipo di pirogeno (pirogeno endogeno) e questo a sua volta avvia la risposta febbrile e una moltitudine di altre reazioni biologiche.

Effetti biologici delle endotossine

La grande varietà di effetti biologici attribuiti ai pirogeni batterici ha suscitato un notevole interesse. \3\, \4\ Le reazioni dell’ospite ai pirogeni sono previste nelle seguenti categorie: 1) produzione di febbre, 2) shock, e 3) cambiamenti nelle funzioni fisiologiche.

La febbre è un effetto ben noto, da cui il termine “pirogeno”. Circa un’ora dopo l’iniezione di pirogeni nei conigli (o nell’uomo), c’è un aumento della temperatura corporea. Quando i pirogeni batterici sono iniettati in quantità sufficienti, forse in quantità di microgrammi, la febbre prodotta è accompagnata da brividi, dolori corporei, un aumento della pressione sanguigna, e possibilmente uno stato di shock e morte. Da quantità minori di iniezione, il corpo ha mostrato un aumento della permeabilità capillare e un’ampia varietà di altri cambiamenti circolatori. Esempi di questi cambiamenti sono mostrati da una riduzione seguita da un aumento del numero di globuli bianchi, emorragie tumorali e cambiamenti nella pressione venosa.

In casi speciali, i pirogeni possono dimostrare il fenomeno di Shwartzman. Questa è una grave reazione emorragica con necrosi localizzata. Può essere dimostrato in un coniglio che viene prima iniettato per via sottocutanea con un pirogeno batterico, e il coniglio viene poi iniettato per via endovenosa 24 ore dopo con lo stesso pirogeno. Il sito dell’iniezione successiva diventa blu al centro e rosso alla periferia.

La tolleranza ai pirogeni è un’altra reazione importante che si sviluppa quando agli animali vengono fatte ripetute iniezioni di un pirogeno. Si sviluppa una ridotta sensibilità allo stesso e ad altri pirogeni che annulla la risposta febbrile e richiede che l’animale tollerante sia ritirato da ulteriori test sui pirogeni. “Sensibilità” significa che l’animale reagisce ad una quantità minima di materiale pirogeno. Anche se il coniglio è l’animale da test più spesso utilizzato, l’uomo è considerato il più sensibile ai pirogeni.

Tossine batteriche

Ci sono due tipi generali di tossine batteriche. \5. Le esotossine sono prodotte durante la fase di crescita di certi tipi di batteri e sono liberate nel mezzo o nel tessuto. Le esotossine sono di natura proteica e le loro reazioni sono specifiche. Per esempio, il Clostridium botulinum produce un’esotossina di potenza insolita che colpisce solo i tessuti neurologici. Altri esempi ben noti di esotossine sono la tossina del tetano, la tossina di Shiga e la tossina della difterite.

Le endotossine sono un altro tipo di tossina che può essere estratta da una grande varietà di batteri gram-negativi. Il termine “endotossina” è di solito intercambiabile con il termine “pirogeno”, anche se non tutti i pirogeni sono endotossine e i test dei pirogeni da soli non possono essere utilizzati interamente per il rilevamento e la caratterizzazione delle endotossine microbiche. Per produrre un effetto letale nell’animale da esperimento sono necessarie dosi più elevate di endotossine rispetto alle esotossine. Gli effetti prodotti dalle endotossine sull’ospite sono sistemici come febbre e reazioni generali del corpo, piuttosto che effetti strettamente neurologici, come nel caso della maggior parte delle esotossine. Le endotossine si trovano soprattutto nei batteri gram-negativi e si ottengono dopo la morte e l’autolisi delle cellule. Le endotossine sono estratte e associate alla struttura cellulare (parete cellulare). Buoni esempi di batteri produttori di pirogeni sono S. typhosa, E. coli, e Ps. aeruginosa.

Proprietà aggiuntive dei pirogeni

Elencando le proprietà aggiuntive, si può dire che i pirogeni: (1) sono noti per consistere biochimicamente in una sostanza lipidica-polisaccaride-peptidica; (2) sono stabili al calore alla temperatura dell’acqua bollente; (3) hanno una tossicità acuta relativamente bassa per l’uomo; (4) dimostrano un basso ordine di risposta immunitaria; e (5) possono essere prodotti da batteremie gram-negative persistenti che potrebbero avere una mortalità del 50%. \6\

I medici sono istruiti a cercare immediatamente la causa delle batteremie persistenti. Le possibili fonti potrebbero essere la flebite al sito del catetere, l’attrezzatura di infusione o la soluzione parenterale. È interessante notare che la gestione dei pazienti in shock pirogeno include la somministrazione di fluidi parenterali (si spera non pirogeni).

Make It Pyrogen Free

Le procedure battericide come il riscaldamento, la filtrazione o le tecniche di adsorbimento non eliminano i pirogeni dalle soluzioni parenterali. Tutti gli ingredienti devono essere mantenuti privi di pirogeni in primo luogo. Per questa garanzia, il produttore esegue test di screening dei pirogeni completi su tutti gli ingredienti dei farmaci parenterali e provvede alla loro corretta conservazione prima dell’uso. Idealmente, il produttore riconosce le fasi critiche nelle operazioni di produzione che potrebbero consentire la crescita di batteri che producono pirogeni, e controlla queste aree regolarmente. Per esempio, l’acqua nelle vasche di conservazione verrebbe testata per i pirogeni e il produttore insisterebbe su tempi di conservazione minimi in modo che venga usata solo acqua priva di pirogeni. L’acqua senza pirogeni, come “acqua per iniezione” delineata nella USP, è il cuore dell’industria dei parenterali.

Saggio dei pirogeni – USP

L’attuale USP delinea chiaramente il test dei pirogeni. USP XIX considera una soluzione apirogena quando 10 m1/kg sono iniettati in un coniglio e c’è un aumento di temperatura di 0,6 C o più per qualsiasi coniglio, o un aumento totale di più di 1,4 C per tre conigli in un gruppo di tre conigli. Il metodo ufficiale del coniglio richiede molto tempo, spese, addestramento ed esperienza per essere padroneggiato. Ci sono poche scorciatoie. La conseguenza di non testare i pirogeni potrebbe essere ancora più costosa in termini di reazioni dei pazienti e richiami di farmaci.

Saggio dei pirogeni – Lisato di amebociti del limulo

Molti laboratori conducono saggi dei pirogeni per mezzo del metodo del lisato di amebociti del limulo (LAL). \Il metodo LAL è utile soprattutto per lo screening di prodotti che non è possibile testare con il metodo del coniglio. I prodotti meglio testati per le endotossine con le tecniche LAL sono: radiofarmaci, anestetici e molti prodotti biologici. Essenzialmente, il metodo LAL fa reagire l’emolinfa (sangue) di un granchio a ferro di cavallo (limulus polyphemus) con un’endotossina per formare un gel. La quantità di endotossina che gelifica è determinata da tecniche di diluizione che confrontano la formazione di gel di un campione di prova con quella di un pirogeno di riferimento, o da metodi spettrofotometrici che confrontano l’opacità della formazione di gel di un campione di prova con quella di un pirogeno di riferimento. Il test LAL è considerato specifico per la presenza di endotossine ed è almeno cento volte più sensibile del test del coniglio. \8\, \9\ Anche quantità di picogrammi di endotossine possono essere evidenziate dal metodo LAL. Anche se il LAL è un metodo relativamente nuovo di analisi dei pirogeni, è stata dimostrata un’ampia varietà di derivati polisaccaridici che danno risultati positivi al test del limulo e mostrano anche attività febbrile. È anche un fatto che alcune sostanze interferiscono con il test LAL anche quando i pirogeni sono presenti.

Alcune aziende usano il test LAL per lo screening dei pirogeni nelle materie prime, e seguono il test dei pirogeni sul prodotto finale per mezzo del test del coniglio USP. Il test LAL per i pirogeni nei farmaci richiede un emendamento alla NDA su base individuale del prodotto. I reagenti del test LAL sono autorizzati dal Bureau of Biologics. Per i dispositivi, un’azienda deve avere il suo protocollo approvato dal direttore, Bureau of Medical Devices, prima di poter sostituire il test LAL con il coniglio. \Il futuro del test LAL sembra promettente in quanto è stato considerato per l’inclusione nella USP, ma non è un metodo ufficiale in questo momento.

Quello che è certo è che i pirogeni rimangono una potenziale fonte di pericolo con l’uso della terapia parenterale. L’esclusione totale dei pirogeni richiede la nostra continua sorveglianza relativa alla produzione di farmaci parenterali. \a)\parenterale (para = oltre; enteron = intestino) Non attraverso il tratto alimentare ma per qualche altra via, come sottocutanea, intramuscolare, endovenosa, intraspinale, ecc.

b)\pirogeno – un agente che produce febbre di origine batterica; endotossina. Dizionario medico illustrato di Dorland. 25° E.W.B. Saunders, Philadelphia.

1. Singer, Charles Joseph; Underwood, Edgar Ashworth. Una breve storia della medicina. 2nd Ed., 1962. Oxford Univ. Press, NY e Oxford.
2. Hindman, S. H. et al. “Pyrogenic Reactions During Haemodialyzing Caused by Endotoxin.” Lancet 2 (7938): 732-4, 18 ottobre 1975.
3. Kadis, Solomon; Weinbaum, George; Ajl, Samuel J.; Microbial Toxins Vol. IV & V. 1971 Academic Press, NY & London.
4. Davis, Bernard E, et al. Endotossine: Textbook of Microbiology, pp 615-7. Quarta stampa. Hoeber Medical Division. Harper & Row Publishers, NY.
5. Stainer, Roger Y.; Doudoroff, Michael; Adelberg, Edward A. The Microbial World, Prentice Hall, Inc, 1970.
6. Krupp, Marcus A. & Chatton, Milton J.; Current Medical Diagnosis and Treatment. p. 775, Lange Medical Publications, 1975, Los Altos, CA
7. Rastogi, S. C.; Hochstein, H. D.; Seligman, E. B. Jr.; “Statistical Determination of Endotoxin Content in Influenza Virus Vaccine by the Limulus Amoebocyte Lysate Test”. J. Clin Microbiol 6(2): 144-8, agosto 1977.
8. Nandan, R.; Nakashima, C. Y., Brown, D. R.; “Detection of Endotoxins in Human Blood and Plasma. Un test pirogeno in vitro migliorato. Clin Chem 23(11): 2080-4 Nov. 1977.
9. Wachtel, R. E.; Tskji, K.; “Comparazione dei lisati di amebociti di Limulus e correlazione con il test pirogeno USP”. Appl. Environ. Microbiology 33(6) 1265-9, giugno 1977.
10. Docket No. 77N-0282 come trovato in FR Doc. 77-31926 File 11-3-77 (Vol. 42, No. 213 — Friday, November 4, 1977) e come trovato in FR Doc. 78-623 Archiviato 1-12-78 (Vol. 43, No. 9 — Venerdì, 3 gennaio 1978)