För att bestämma KM- och Vmax-värdena krävdes algebraisk manipulering av den grundläggande Michaelis-Menten-ekvationen innan datorer fanns tillgängliga. Eftersom Vmax närmar sig asymptotiskt (se figur 8.11) är det omöjligt att få fram ett definitivt värde från en typisk Michaelis-Menten-plott. Eftersom KM är substratkoncentrationen vid Vmax/2 är det likaså omöjligt att bestämma ett exakt värde för KM. Vmax kan dock bestämmas exakt om Michaelis-Menten-ekvationen omvandlas till en ekvation som ger en rätlinjig kurva. Om man tar reciproken av båda sidorna av ekvation 23 får man
En plott av 1/V0 mot 1/, som kallas Lineweaver-Burk- eller dubbelreciprok plott, ger en rät linje med ett intercept av 1/Vmax och en lutning av KM/Vmax (figur 8.36). Interceptet på x-axeln är -1/KM.
Figur 8.36
En dubbelreciprok eller Lineweaver-Burk-plot. En dubbel-reciprok plott av enzymkinetik genereras genom att plotta 1/V0 som en funktion 1/. Lutningen är KM/Vmax, interceptet på den vertikala axeln är 1/Vmax och interceptet på den horisontella axeln (mer…)
Dubbel-reciproka plottar är särskilt användbara för att skilja mellan kompetitiva och icke-kompetitiva hämmare. Vid kompetitiv hämning är interceptet på y-axeln i plottet av 1/V0 mot 1/ detsamma i närvaro och i frånvaro av hämmare, även om lutningen ökar (figur 8.37). Att interceptet är oförändrat beror på att en kompetitiv hämmare inte ändrar Vmax. Vid en tillräckligt hög koncentration är praktiskt taget alla aktiva platser fyllda av substrat och enzymet är fullt verksamt. Ökningen av lutningen i diagrammet 1/V0 mot 1/ indikerar bindningsstyrkan hos den kompetitiva hämmaren. I närvaro av en kompetitiv hämmare ersätts ekvation 31 med
i vilken är koncentrationen av hämmare och Ki är dissociationskonstanten för enzym-hämmarkomplexet.
Figur 8.37
Kompetitiv hämning illustrerad på en dubbelreciprok plott. En dubbelreciprok plott av enzymkinetik i närvaro (
)och frånvaro (
) av en kompetitiv hämmare illustrerar att hämmaren inte har någon effekt på Vmax men ökar KM.
Med andra ord ökar lutningen i diagrammet med faktorn (1 + /Ki) i närvaro av en kompetitiv hämmare. Betrakta ett enzym med en KM på 10-4 M. I frånvaro av hämmare är V0 = Vmax/2 när = 10-4 M. I närvaro av 2 × 10-3 M konkurrerande hämmare som är bunden till enzymet med en Ki på 10-3 M kommer den skenbara KM (KappM ) att vara lika med KM × (1 + /Ki), eller 3 × 10-4 M. Genom att sätta in dessa värden i ekvation 23 får man V0 = Vmax/4, när = 10-4 M. Närvaron av den kompetitiva hämmaren halverar alltså reaktionshastigheten vid denna substratkoncentration.
I icke-kompetitiv hämning (figur 8.38) kan hämmaren kombinera sig med antingen enzymet eller enzym-substratkomplexet. Vid ren icke-kompetitiv hämning är värdena på dissociationskonstanterna för hämmare och enzym och för hämmare och enzym-substratkomplex lika (avsnitt 8.5.1). Värdet för Vmax minskas till ett nytt värde som kallas Vappmax, och därför ökas interceptet på den vertikala axeln. Den nya lutningen, som är lika med KM/Vappmax, är större med samma faktor. Till skillnad från Vmax påverkas inte KM av ren icke-kompetitiv hämning. Den maximala hastigheten i närvaro av en ren icke-kompetitiv hämmare, Vimax, ges av
Figur 8.38
Non-konkurrerande hämning illustrerad på en dubbelreciprok plott. En dubbel reciprok plott av enzymkinetik i närvaro (
) och frånvaro (
) av en icke-kompetitiv hämmare visar att KM är oförändrad och Vmax är minskad.